桔青霉产核酸酶P1酶分离纯化及其酶学性质

李明; 余华顺; 喻晨; 吴尧; 龚大春

doi:10.13386/j.issn1002-0306.2020050212

桔青霉产核酸酶P1酶分离纯化及其酶学性质

doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2020050212

李明^{1, 2, 3,},
余华顺^{2, 3},
喻晨^{2, 3},
吴尧^{2, 3},
龚大春^{1, 2, 3, ,}

1.
三峡大学生物与制药学院，湖北宜昌 443002
2.
中国轻工业功能酵母重点实验室（三峡大学），湖北宜昌 443002
3.
安琪酵母股份有限公司特种酶制剂事业部，湖北宜昌 443003

基金项目: 国家自然科学基金项目(21776162)；三峡大学学位论文培优基金项目资助(2019SSPY151)

详细信息

作者简介:
李明（1989−），女，硕士研究生，研发工程师，研究方向：酶工程，E-mail：1239825954@qq.com

通讯作者:
龚大春（1967−），男，博士，教授，研究方向：生物催化和手性化合物的研究与开发，E-mail：185195061@qq.com

中图分类号: O629
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出版历程
- 收稿日期: 2020-05-20
- 网络出版日期: 2021-01-28

Isolation, Purification and Enzymatic Properties of Nuclease P1 Fermented by Penicillium citrinum

Ming LI^{1, 2, 3
,},
Huashun YU^{2, 3},
Chen YU^{2, 3},
Yao WU^{2, 3},
Dachun GONG^{1, 2, 3
, ,}

1.
Three Gorges University, Yichang 443002, China
2.
China Key Laboratory of Light Industry Functional Yeast, China Three Gorges University, Yichang 443002, China
3.
Angel Yeast Co.,Ltd, Special Enzyme Division, Yichang 443003, China

摘要

摘要: 桔青霉（Penicillium citrinum）产核酸酶P1浓缩液采用活性炭脱色、硫酸铵分级沉淀、脱盐和凝胶层析等分离技术，得到核酸酶P1纯组分，并研究了该酶的酶学性质。该酶纯化后比酶活达到33967 U/mg，纯化倍数为8.48倍；该酶的米氏常数K_m、最大反应速度V_m和催化常数K_cat分别为2.50 mmol/L、0.0864 mmol/（mL·min）和252.43 s⁻¹。该酶最适温度为75 ℃，热稳定范围60～75 ℃；最适pH为5.5，pH稳定范围为4.0～6.0；Zn²⁺在1 mmol/L条件下对核酸酶P1有很好的激活作用，Cu²⁺和Co²⁺对该酶的抑制作用明显，而Ni²⁺、Fe²⁺、Mn²⁺等离子具有不同程度的抑制作用。本研究对于该酶的广泛应用奠定科学基础。
- 核酸酶P1 /
- 纯化 /
- 动力学参数 /
- 酶学性质
Abstract: The nuclease P1 was purified to obtain pure component by activated carbon decolorization, (NH₄)₂SO₄ precipitation, desalination and gel chromatography and its enzymatic properties was investigated. This purified enzyme had a specific activity of 33967 U/mg protein after 8.48-fold purification. The Michaelis constant (K_m), the maximum reaction rates (V_m) and the catalytic constant (K_ca_t) of the purified enzyme were 2.50 mmol/L, 0.0864 mmol/(mL·min) and 252.43 s⁻¹, respectively. The optimization pH and temperature for the nuclease P1 were at pH5.5 and 75 ℃. The enzyme was stable in the temperature range from 60 to 75 ℃ and in the pH range from 4.0 to 6.0. Zn²⁺ had a positive effect on the enzyme activity, while Cu²⁺ was a strong inhibitor of nuclease P1, Ni²⁺、Fe²⁺、Mn²⁺ had the different inhibition. This research laid a scientific foundation for the extensive application of the enzyme.
- nuclease P1 /
- purification /
- kinetic parameter /
- enzymatic property

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图 1 不同活性炭用量对脱色效果的影响

Figure 1. Effect of diffrent amount of activated carbon on decolorization

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图 2 HiTrip^TM Desalting脱盐图谱

Figure 2. The desalination spectrum of HiTrip^TM Desalting

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图 3 Superdex^TM 75 10/300 GL凝胶层析图谱

Figure 3. The chromatogram of Superdex^TM 75 10/300 GL

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图 4 核酸酶P1纯化SDS-PAGE电泳图

注：M：Marker；泳道1：核酸酶P1浓缩液；泳道2：盐析后酶液；泳道3：脱盐后冻干酶；泳道4：核酸酶P1纯化冻干酶。

Figure 4. Purification of SDS-PAGE electrophoresis by the nuclease P1

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图 5 核酸酶的最适pH和pH稳定性

注：A为最适反应pH，B为一定温度条件下pH稳定性。

Figure 5. Optimum pH and pH stability of nuclease P1

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图 6 核酸酶P1最适反应温度和温度稳定性

注：A为最适反应温度，B为一定pH条件下温度稳定性

Figure 6. Optimum reaction temperature and temperature stability of nuclease P1

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图 7 金属离子对核酸酶P1活性的影响

Figure 7. The effect of metal ion on nuclease P1 activity

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图 8 核酸酶P1的动力学参数测定双倒数图

Figure 8. Double-reciprocal plot for determination of nuclease P1 dynamics parameters

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表 2 各分离步骤的纯化结果

Table 2. Purification result of each separation step

纯化过程样品	蛋白浓度（mg/mL）	蛋白总量（g）	比酶活（U/mg）	纯化倍数
浓缩酶液	3.64	3.458	4005	—
脱色酶液	2.85	2.28	10730	2.68
盐析	6.58	0.79	15157	3.78
脱盐	5.65	0.339	24262	6.06
凝胶层析	5.31	0.212	33967	8.48

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表 1 不同浓度硫酸铵分级沉淀的比酶活

Table 1. The specific enzyme of (NH₄)₂SO₄ fractionation

硫酸铵饱和度（%）	上清液蛋白（mg/mL）	沉淀溶解后蛋白（mg/mL）	上清液比酶活（U/mg）	沉淀比酶活（U/mg）
40	2.63	1.43	11984	1252
50	2.27	1.65	14194	7860
60	1.90	3.66	6733	11330
65	1.31	6.58	2532	15157
70	0.86	14.86	1732	9306
75	0.52	7.33	1418	7617
80	0.39	3.01	970	5782
85	0.22	0.97	457	988

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