桔青霉产核酸酶P1酶分离纯化及其酶学性质

李明 余华顺 喻晨 吴尧 龚大春

李明,余华顺,喻晨,等. 桔青霉产核酸酶P1酶分离纯化及其酶学性质[J]. 食品工业科技,2021,42(7):89−94. doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2020050212
引用本文: 李明,余华顺,喻晨,等. 桔青霉产核酸酶P1酶分离纯化及其酶学性质[J]. 食品工业科技,2021,42(7):89−94. doi: 10.13386/ j.issn1002-0306.2020050212
LI Ming, YU Huashun, YU Chen, et al. Isolation, Purification and Enzymatic Properties of Nuclease P1 Fermented by Penicillium citrinum[J]. Science and Technology of Food Industry, 2021, 42(7): 89−94. (in Chinese with English abstract). doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2020050212
Citation: LI Ming, YU Huashun, YU Chen, et al. Isolation, Purification and Enzymatic Properties of Nuclease P1 Fermented by Penicillium citrinum [J]. Science and Technology of Food Industry, 2021, 42(7): 89−94. (in Chinese with English abstract). doi: 10.13386/j.issn 1002-0306.2020050212

桔青霉产核酸酶P1酶分离纯化及其酶学性质

doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2020050212
基金项目: 国家自然科学基金项目(21776162);三峡大学学位论文培优基金项目资助(2019SSPY151)
详细信息
    作者简介:

    李明(1989−),女,硕士研究生,研发工程师,研究方向:酶工程,E-mail:1239825954@qq.com

    通讯作者:

    龚大春(1967−),男,博士,教授,研究方向:生物催化和手性化合物的研究与开发,E-mail:185195061@qq.com

  • 中图分类号: O629

Isolation, Purification and Enzymatic Properties of Nuclease P1 Fermented by Penicillium citrinum

  • 摘要: 桔青霉(Penicillium citrinum)产核酸酶P1浓缩液采用活性炭脱色、硫酸铵分级沉淀、脱盐和凝胶层析等分离技术,得到核酸酶P1纯组分,并研究了该酶的酶学性质。该酶纯化后比酶活达到33967 U/mg,纯化倍数为8.48倍;该酶的米氏常数Km、最大反应速度Vm和催化常数Kcat分别为2.50 mmol/L、0.0864 mmol/(mL·min)和252.43 s−1。该酶最适温度为75 ℃,热稳定范围60~75 ℃;最适pH为5.5,pH稳定范围为4.0~6.0;Zn2+在1 mmol/L条件下对核酸酶P1有很好的激活作用,Cu2+和Co2+对该酶的抑制作用明显,而Ni2+、Fe2+、Mn2+等离子具有不同程度的抑制作用。本研究对于该酶的广泛应用奠定科学基础。
  • 图  1  不同活性炭用量对脱色效果的影响

    Figure  1.  Effect of diffrent amount of activated carbon on decolorization

    图  2  HiTripTM Desalting脱盐图谱

    Figure  2.  The desalination spectrum of HiTripTM Desalting

    图  3  SuperdexTM 75 10/300 GL凝胶层析图谱

    Figure  3.  The chromatogram of SuperdexTM 75 10/300 GL

    图  4  核酸酶P1纯化SDS-PAGE电泳图

    注:M:Marker;泳道1:核酸酶P1浓缩液;泳道2:盐析后酶液;泳道3:脱盐后冻干酶;泳道4:核酸酶P1纯化冻干酶。

    Figure  4.  Purification of SDS-PAGE electrophoresis by the nuclease P1

    图  5  核酸酶的最适pH和pH稳定性

    注:A为最适反应pH,B为一定温度条件下pH稳定性。

    Figure  5.  Optimum pH and pH stability of nuclease P1

    图  6  核酸酶P1最适反应温度和温度稳定性

    注:A为最适反应温度,B为一定pH条件下温度稳定性

    Figure  6.  Optimum reaction temperature and temperature stability of nuclease P1

    图  7  金属离子对核酸酶P1活性的影响

    Figure  7.  The effect of metal ion on nuclease P1 activity

    图  8  核酸酶P1的动力学参数测定双倒数图

    Figure  8.  Double-reciprocal plot for determination of nuclease P1 dynamics parameters

    表  2  各分离步骤的纯化结果

    Table  2.   Purification result of each separation step

    纯化过程样品蛋白浓度
    (mg/mL)
    蛋白总量
    (g)
    比酶活
    (U/mg)
    纯化倍数
    浓缩酶液3.643.4584005
    脱色酶液2.852.28107302.68
    盐析6.580.79151573.78
    脱盐5.650.339242626.06
    凝胶层析5.310.212339678.48
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    表  1  不同浓度硫酸铵分级沉淀的比酶活

    Table  1.   The specific enzyme of (NH4)2SO4 fractionation

    硫酸铵饱和度(%)上清液蛋白(mg/mL)沉淀溶解后蛋白(mg/mL)上清液比酶活(U/mg)沉淀比酶活(U/mg)
    402.631.43119841252
    502.271.65141947860
    601.903.66673311330
    651.316.58253215157
    700.8614.8617329306
    750.527.3314187617
    800.393.019705782
    850.220.97457988
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  • [1] 王定昌. 核苷酸的生产技术及应用前景[J]. 粮油食品科技,2008,16(3):65−66. doi:  10.3969/j.issn.1007-7561.2008.03.024
    [2] 喻晨, 赵劼, 张亚雄, 等. 桔青霉发酵制备核酸酶P1研究进展[J]. 食品工业科技,2010,31(11):416−420.
    [3] 张蕉南. 酵母核苷酸在水产动物上的研究进展与应用前景[J]. 饲料工业,2016,37(14):28−31.
    [4] Xiaoyi Chen, Bin Wang, Li Pan. Heterologous expression and characterization of Penicillium citrinum nuclease P1 in Aspergillus niger and its application in the preparation of nucleotides[J]. Protein Expression and Purification,2019(156):36−43.
    [5] Bai Zuhai, Chen Yan, Li Fei, et al. Electrochemical aptasensor for sulfadimethoxine detection based on the triggered cleavage activity of nuclease P1 by aptamer-target complex[J]. Talanta,2019(204):409−414.
    [6] 李兆飞, 姚娟, 余华顺, 等. 氯化锂-离子束复合诱变核酸酶P1高产菌株研究[J]. 食品科技,2013,38(12):2−4, 8.
    [7] 郑美娟, 郭金玲, 田毅红, 等. 桔青霉产核酸酶P1菌种高效选育方法研究[J]. 化学与生物工程,2018,35(2):33−37. doi:  10.3969/j.issn.1672-5425.2018.02.006
    [8] 梁剑光, 顾秋忆, 秦修东, 等. 利用常压室温等离子体(ARTP)诱变选育高产核酸酶P1菌株[J]. 食品工业科技,2015,36(21):183−186.
    [9] 梁新乐, 孙隽, 张虹, 等. TB-DNA平板高效筛选桔青霉核酸酶P1产量突变株[J]. 中国食品学报,2012,12(9):103−108.
    [10] 廖明义. 产核酸酶P1菌株的诱变选育及发酵动力学研究[D]. 武汉: 华中农业大学, 2011: 34-35.
    [11] 廖明义, 陈雯莉. 桔青霉发酵制备核酸酶P1的发酵动力学研究[J]. 食品工业科技,2012,33(3):180−182, 316.
    [12] 田吕明, 叶炜, 赵劫, 等. 桔青霉摇瓶发酵生产核酸酶P1的动力学研究[J]. 工业微生物,2012,42(2):38−42. doi:  10.3969/j.issn.1001-6678.2012.02.008
    [13] 田吕明, 叶炜, 赵劫, 等. 响应面法优化桔青霉产核酸酶P1培养基[J]. 食品科技,2011,36(10):23−27.
    [14] 喻晨, 张亚雄, 赵劫, 等. 响应面法优化桔青霉产核酸酶P1培养基[J]. 食品科学,2011,32(17):283−286.
    [15] 廖红东, 莫晓燕, 宋威, 等. 核酸酶P1的分离纯化及部分酶学性质研究[J]. 中国医药工业杂质,2005,36(9):536−538.
    [16] 吕浩, 应汉杰. 核酸酶P1的纯化和酶学性质研究[J]. 南京工业大学学报,2002,6(24):66−69.
    [17] 桂丽, 孙谧, 刘均忠, 等. 中性蛋白酶发酵液脱色工艺优化[J]. 食品与发酵工业,2016,42(8):92−96.
    [18] Y Guoqing, Lu E Shi, Yi Yu, et al. Production, purification and characterization of nuclease P1 from Penicilliun citrinum[J]. Process Biochemistry,2006,41:1276−1281. doi:  10.1016/j.procbio.2005.12.028
    [19] 刘峄, 雷玲玲, 刘慧芹, 等. 2265FS土壤原位电导仪测定结果与土壤含盐量的关系[J]. 湖北农业科学,2014,53(13):3167−3169. doi:  10.3969/j.issn.0439-8114.2014.13.049
    [20] 夏宁, 王晓琪, 严文冰, 等. 豆浆脂肪氧合酶测定方法的优化及酶动力学的研究[J]. 大豆科学,2018,37(5):769−775.
    [21] 胡晓倩, 陈雅蕙, 邓爱平, 等. 谷胱甘肽转硫酶酶促动力学实验设计[J]. 实验技术与管理,2002,19(1):27−31. doi:  10.3969/j.issn.1002-4956.2002.01.009
    [22] Lineweaver H, Burke D. Determination of enzyme dissociation constants[J]. America Chemistry Society,1934,56(3):658−666. doi:  10.1021/ja01318a036
    [23] 武林贺, 白新鹏, 吴谦, 等. 脂肪酶水解椰子油动力学研究[J]. 食品研究与开发,2016,37(16):65−69. doi:  10.3969/j.issn.1005-6521.2016.16.017
    [24] 景一娴, 饶菁菁, 廖飞, 等. 低于米氏常数底物浓度下酶动力学参数的测定[J]. 重庆医科大学学报,2018,43(11):1464−1468.
    [25] Robert R Rando. Chemistry and enzymology of kcat Inhibitors[J]. Science,1974,185:320−324. doi:  10.1126/science.185.4148.320
    [26] Robert Eisenthal, Michael J Danson, David W Hough. Catalytic effificiency and Kcat/Km: a useful comparator[J]. Trends in Biotechnology,2007,425(6):247−249.
    [27] 安扬东方. 阴沟肠杆菌海藻糖酶酶学性质鉴定及体外分子改良[D]. 武汉: 华中农业大学, 2017.
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  • 收稿日期:  2020-05-20
  • 网络出版日期:  2021-01-28

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