致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌分离鉴定及三重PCR检测方法的建立

张楠驰 苟小兰 王利

张楠驰,苟小兰,王利. 致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌分离鉴定及三重PCR检测方法的建立[J]. 食品工业科技,2021,42(7):95−101. doi:  10.13386/j.issn1002-0306.2020050227
引用本文: 张楠驰,苟小兰,王利. 致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌分离鉴定及三重PCR检测方法的建立[J]. 食品工业科技,2021,42(7):95−101. doi:  10.13386/j.issn1002-0306.2020050227
ZHANG Nanchi, GOU Xiaolan, WANG Li. Isolation and Identification of Pathogenic Yersinia enterocolitica and Development of a Triple PCR Detection Method[J]. Science and Technology of Food Industry, 2021, 42(7): 95−101. (in Chinese with English abstract). doi:  10.13386/j.issn1002-0306.2020050227
Citation: ZHANG Nanchi, GOU Xiaolan, WANG Li. Isolation and Identification of Pathogenic Yersinia enterocolitica and Development of a Triple PCR Detection Method[J]. Science and Technology of Food Industry, 2021, 42(7): 95−101. (in Chinese with English abstract). doi:  10.13386/j.issn1002-0306.2020050227

致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌分离鉴定及三重PCR检测方法的建立

doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2020050227
基金项目: 四川省科技支撑项目(2016NZ0044)
详细信息
    作者简介:

    张楠驰(1993−),男,硕士,研究方向:微生物遗传学,E-mail:zhangnanchi@126.com

    通讯作者:

    王利(1977−),女,博士,教授,研究方向:微生物遗传学,E-mail:qinxin916@aliyun.com

  • 中图分类号: TS254.7

Isolation and Identification of Pathogenic Yersinia enterocolitica and Development of a Triple PCR Detection Method

  • 摘要: 为鉴定导致患病鲫鱼肛门红肿、腹部有出血点症状的病原菌,并建立一种快速检测该病原菌的方法。本研究从患病鲫鱼中分离了病原菌,采用形态学、理化特性分析及16S rDNA序列分析方法鉴定菌株。采用PCR扩增法检测该菌毒力基因,琼脂纸片扩散法检测该菌株的耐药性,致病性能验证试验检测其致病性。针对该菌ail基因、inv基因和intB基因设计了3条特异性引物,通过对反应体系和条件的优化,建立了一种检测该菌的三重PCR方法并初步应用于患病鲫鱼样品的检测中。结果显示,从患病鲫鱼心脏组织中分离了一株小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica),命名为fsznc-10。检测到该菌携带ailystBvirFintB毒力基因,该菌对诺氟沙星、庆大霉素等5种抗生素敏感,对鲫鱼具有一定的致病性。三重PCR方法可准确扩增出小肠结肠炎耶尔森氏菌ailinvintB三个目的基因,而其他菌株均未扩增出目的基因。该方法检测该菌DNA最低检出量为1.704×10−6 ng/μL,检测患病鱼心脏样品的阳性率约为86.67%,与16S rDNA序列分析方法的检测符合率为100%。本试验建立的三重PCR检测法具有特异性强、敏感性高、操作简单、成本低的优点。这为临床中小肠结肠炎耶尔森氏菌的防控和检测提供参考依据。
  • 图  1  分离菌16S rDNA基因PCR扩增结果

    Figure  1.  PCR amplification results of 16S rDNA gene of the isolate strain

    注:M: DL2000DNA Marker; 1: fsznc-10

    图  2  菌株fsznc-10 16S rDNA基因序列的系统发育树

    Figure  2.  Phylogenetic tree of strain fsznc-10 16S rDNA gene sequence

    图  3  毒力基因的PCR扩增结果

    注:M: DL2000; 1: ail; 2: ystB; 3: virF; 4: yadA; 5: intB

    Figure  3.  PCR amplification of virulence gene

    图  4  单一PCR与多重PCR扩增结果

    注:M: DL2000DNA Marker; 1: ail; 2: inv; 3: intB;4: 三重PCR结果。

    Figure  4.  Results of single PCR and multiplex PCR amplifications

    图  5  三重PCR的特异性检测

    注:M:DL2000DNA Marker;1~15:fsznc-10、假结核耶尔森氏菌、维氏气单胞菌、哈维氏弧菌、门多萨假单胞菌、霍乱弧菌、嗜水气单胞菌、弗劳地枸橼酸杆菌、中间气单胞菌、粪肠球菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、类志贺邻单胞菌、霍氏肠杆菌、无丙二酸枸橼酸杆菌;16:阴性对照。

    Figure  5.  Specificity detection of triple PCR

    图  6  三重PCR的敏感性试验结果

    注:M:DL2000DNA Marker;1~10:菌株fsznc-10稀释100~109倍;11:阴性对照。

    Figure  6.  Sensitivity test results of triple PCR

    图  7  临床样品三重PCR检测结果

    注:M:DL2000DNA Marker;1~15:临床样品;16:阴性对照。

    Figure  7.  Triple PCR results of clinical samples

    表  1  小肠结肠炎耶尔森氏菌毒力基因引物序列

    Table  1.   Primers of the virulence genes in the Y. enterocolitic strains

    引物序列(5'→3')预测长度(bp)GenBank登录号退火温度(℃)
    ailForwardtaa tgt gta cgc tgc gag351M2994550.0
    Reversegac gtc tta ctt gca ctg
    ystBForwardgta cat tag gcc aag aga cg200GU22927660.3
    Reversegca aca tac ctc aca aca cc
    virFForwardggc aga aca gca gtc aga cata561NC004564.45.0
    Reverseggt gag cat aga gaa tac gtc g
    yadAForwardctt cag ata ctg gtg tcg ctg t800NC00456458.5
    Reverseatg cct gac tag agc gat atc c
    intBForwardtgc gcc atg cgg tcc atc714NC00880050.0
    Reverseggt gca taa gat tct cgg
    Inv*Forwardctg tgg gga gac tgg gga agt ttg g520CAA8818850.0
    Reversegaa ctg ctt gaa tcc ctg aaa acc g
    注:*仅应用于菌株fsznc-10的三重PCR检测。
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    表  2  药敏实验结果

    Table  2.   Results of antibiotic sensitivity test

    抗菌药物结果抗菌药物结果
    氨苄青霉素R诺氟沙星S
    庆大霉素S多粘菌素S
    头孢曲松I呋喃唑酮R
    阿米卡星S链霉素S
    复方新诺明I头孢噻吩R
    注:R:耐药;I:中度敏感;S:敏感。
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出版历程
  • 收稿日期:  2020-05-22
  • 网络出版日期:  2021-01-28
  • 刊出日期:  2021-04-01

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