重组鲍鱼肌肉脯氨酰内肽酶的性质研究

李婉玉 李越 翁凌 陈守峰 陈玉磊 刘光明 曹敏杰

李婉玉,李越,翁凌,等. 重组鲍鱼肌肉脯氨酰内肽酶的性质研究[J]. 食品工业科技,2021,42(7):129−135. doi:  10.13386/j.issn1002-0306.2020060196
引用本文: 李婉玉,李越,翁凌,等. 重组鲍鱼肌肉脯氨酰内肽酶的性质研究[J]. 食品工业科技,2021,42(7):129−135. doi:  10.13386/j.issn1002-0306.2020060196
LI Wanyu, LI Yue, WENG Ling, et al. Study on the Properties of Recombinant Prolyl Endopeptidase from Abalone ( Haliotis discus hannai) Muscle[J]. Science and Technology of Food Industry, 2021, 42(7): 129−135. (in Chinese with English abstract). doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2020060196
Citation: LI Wanyu, LI Yue, WENG Ling, et al. Study on the Properties of Recombinant Prolyl Endopeptidase from Abalone ( Haliotis discus hannai ) Muscle[J]. Science and Technology of Food Industry, 2021, 42(7): 129−135. (in Chinese with English abstract). doi: 10.13386/ j.issn1002-0306.2020060196

重组鲍鱼肌肉脯氨酰内肽酶的性质研究

doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2020060196
基金项目: 国家重点研发计划项目(2018YFD0901004);国家自然科学基金(31772049)
详细信息
    作者简介:

    李婉玉(1993−),女,硕士研究生,研究方向:水产加工,E-mail:810457794@qq.com

    通讯作者:

    曹敏杰(1964−),男,博士,教授,研究方向:水产加工、蛋白质化学,E-mail:mjcao@jmu.edu.cn

  • 中图分类号: Q556+.3

Study on the Properties of Recombinant Prolyl Endopeptidase from Abalone (Haliotis discus hannai) Muscle

  • 摘要: 为研究皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)中脯氨酰内肽酶(Prolyl endopeptidase,Hdh-PEP)的酶学特性与结构特性,利用基因工程技术重组并在大肠杆菌中高效表达了皱纹盘鲍PEP。原核表达的Hdh-PEP分子量为85 kDa,在pH2~6、温度20~60 ℃条件下,Hdh-PEP的表面疏水性明显升高。氨基酸序列同源性分析结果表明,Hdh-PEP催化结构域中有三个高度保守的氨基酸序列:Seq 1:K-D-G-T-K/R-I-P、Seq 2:Y-G-Y-G-G-F和Seq 3:I-R-G-G-E-Y/F。酶动力学研究表明,Hdh-PEP的米氏常数Km为5.32 μmol/L,催化常数kcat值为15.7 s−1。PEP的特异性抑制剂SUAM-14746和ZPP对Hdh-PEP酶活力具有强抑制作用,丝氨酸蛋白酶抑制(PMSF)对Hdh-PEP酶活力也有较大程度的抑制作用。本实验制备了高特异性抗Hdh-PEP多克隆抗体,可检测鲍鱼肌肉中天然PEP的存在情况。Hdh-PEP的体外高效表达和特异性多克隆抗体制备为后续深入研究Hdh-PEP的性质提供了重要参考。
  • 图  1  Hdh-PEP在鲍鱼不同组织中的相对酶活

    Figure  1.  Relative enzymatic activity of Hdh-PEP in different tissues

    图  2  纯化Hdh-PEP的SDS-PAGE分析

    注:M,标准蛋白;1,表达菌株的全菌液;2,表达菌株的上清液;3,纯化后的Hdh-PEP。

    Figure  2.  SDS-PAGE analysis of purified Hdh-PEP

    图  3  PEP的氨基酸序列和二级结构比对

    注:1,Hdh-PEP;2,Gm-PEP;3,Pc-PEP;4,Hm-PEP;5,Mx-PEP;蓝色实线,催化结构域;蓝色虚线,β-螺旋桨结构域;红色,保守的氨基酸序列。

    Figure  3.  Amino acid sequence and secondary structure comparison of PEPs

    图  4  Hdh-PEP的Lineweaver-Burk双倒数图

    Figure  4.  Lineweaver-Burk double reciprocal of Hdh-PEP

    图  5  pH和温度对Hdh-PEP表面疏水性的影响

    注:A、C,pH和温度对荧光强度的影响;B、D,pH和温度对疏水指数的影响。

    Figure  5.  Effect of pH and temperature on the surface hydrophobicity of Hdh-PEP

    图  6  Hdh-PEP多克隆抗体的SDS-PAGE分析和Hdh-PEP的Western blotting分析

    注:A,Hdh-PEP多克隆抗体的SDS-PAGE;B,Hdh-PEP的Western blotting分析。泳道M,标准蛋白;1,Hdh-PEP多克隆抗体;2,鲍鱼肌肉蛋白;3,天然Hdh-PEP的Western blotting分析。

    Figure  6.  SDS-PAGE analysis of Hdh-PEP polyclonal antibody and western blotting analysis of Hdh-PEP

    表  1  蛋白酶抑制剂对Hdh-PEP的作用

    Table  1.   Effect of proteinase inhibitors on the activity of Hdh-PEP

    抑制剂终浓度(μmol/L)相对酶活(%)
    对照组0100.0
    SUAM-1474655.7
    ZPP56.9
    PMSF558.5
    EDTA286.9
    EGTA598.2
    E-64589.5
    Benzamidine196.7
    Leupeptin594.1
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出版历程
  • 收稿日期:  2020-06-16
  • 网络出版日期:  2021-01-28
  • 刊出日期:  2021-04-01

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