健康婴儿粪便样本中加氏乳杆菌的分离鉴定及安全性评价

李国花; 赵馨; 张明新; 马雨哲; 张歆怡; 钱卫生; 鲁曦

doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022060178

健康婴儿粪便样本中加氏乳杆菌的分离鉴定及安全性评价

doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2022060178

1.
陕西科技大学食品与生物工程学院，陕西西安 710021
2.
空军军医大学唐都医院，陕西西安 710032

基金项目: 国家自然科学基金（31970115）；陕西省重点研发计划（2022NY-030）。

详细信息

作者简介:
李国花（1997−），女，硕士研究生，研究方向：益生菌筛选和功能鉴定，E-mail：486806391@qq.com

通讯作者:
鲁曦（1983−），男，博士，副教授，研究方向：益生菌筛选与功能鉴定，E-mail：luxi1126@163.com

中图分类号: TS201.3
计量
- 文章访问数: 64
- HTML全文浏览量: 19
- PDF下载量: 14
- 被引次数: 0
出版历程
- 收稿日期: 2022-06-20
- 网络出版日期: 2022-12-14
- 刊出日期: 2023-01-17

Isolation, Identification and Safety Evaluation of Lactobacillus gasseri from Fecal Samples of Healthy Infants

1.
College of Food and Bioengineering, Shaanxi University of Science and Technology, Xi'an 710021, China
2.
Tangdu Hospital of Air Force Military Medical University, Xi'an 710032, China

摘要

摘要: 目的：本研究从125例健康婴儿粪便样本中分离鉴定出加氏乳杆菌（Lactobacillus gasseri）并对其安全性和抑菌性能进行评价。方法：本研究以1月龄健康婴儿粪便样本为对象，经过MRS培养基分离纯化、革兰氏染色、生化鉴定和16S rRNA测序技术进行菌种鉴定；随后，对分离得到的加氏乳杆菌利用血琼脂平板进行溶血性评价；利用微量肉汤稀释法对常见抗生素的药物敏性进行测定，并对加氏乳杆菌的安全性进行评价；最后，采用牛津杯法检测对大肠杆菌ATCC 25922和金黄色葡萄球菌ATCC 25923的抑制作用。结果：从125例健康婴儿粪便样本中成功分离并鉴定出15株加氏乳杆菌。溶血性检测结果显示，14株均无溶血性；待测菌株对四环素、万古霉素、利奈唑胺、利福平敏感性较高，对亚胺培南完全敏感，对甲氧苄啶完全耐药；抑菌实验结果显示，有6株菌同时对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有抑菌效果。结论：本研究从健康婴儿粪便样本中成功分离筛选出3株安全性较高且对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌同时具有一定抑制作用的加氏乳杆菌，编号分别为：LGI 6-1、LGI 6-2、LGI 6-3，作为潜在的益生菌资源，为后续深入探究加氏乳杆菌功能提供研究对象。
- 加氏乳杆菌 /
- 婴儿粪便 /
- 分离鉴定 /
- 安全性 /
- 抑菌性 /
- 耐药性
Abstract: Objective: To isolate and identify Lactobacillus gasseri from 125 fecal samples of healthy infants, and to evaluate its safety and antimicrobial activity. Methods: In this study, fecal samples of 1-month-old healthy infants were taken, and the strains were separated by MRS medium, Gram staining, biochemical identification and 16S rRNA sequencing technology were used to strain identification. Subsequently, the hemolysis of the isolated L. gasseri was evaluated by blood agar. The drug sensitivity of antibiotics was determined by micro broth dilution method, and the safety of the isolated strains were evaluated. Finally, the inhibitory effects of the 15 isolated L. gasseri strains on E. coli ATCC 25922 and S. aureus ATCC 25923 were detected by Oxford cup method. Results: Fifteen strains of L. gasseri were successfully isolated from 125 fecal samples of healthy infants. Hemolysis test results showed that 14 strains of them was hemolytic negative. The 15 tested strains were highly sensitive to tetracycline, vancomycin, linezolid and rifampicin, completely sensitive to imipenem and completely resistant to trimethoprim. The results of antibacterial activity test showed that 6 strains could effectively in inhibiting both E. coli and S. aureus. Conclusion: In this study, three strains of L. gasseri were successfully isolated from healthy infant’s fecal samples, which could not only inhibit E. coli and S. aureus, but also passed the safety test (LGI 6-1, LGI 6-2 and LGI 6-3). As potential probiotic resources, they could provide a research target for further research on function exploring.
- Lactobacillus gasseri /
- infant feces /
- isolation and identification /
- security /
- bacteriostasis /
- antimicrobial resistance

HTML全文

图 1 加氏乳杆菌分离、安全性和功能评价流程图

Figure 1. Flow chart for isolation, safety and function evaluation of Lactobacillus gasseri

下载: 全尺寸图片幻灯片

图 2 15株加氏乳杆菌的菌落形态及革兰氏染色结果

Figure 2. Colony morphology and Gram staining results of 15 strains of Lactobacillus gasseri

下载: 全尺寸图片幻灯片

图 3 菌株16S rRNA基因序列系统发育树

Figure 3. Phylogenetic tree of 16S rRNA gene sequence of strain

下载: 全尺寸图片幻灯片

图 4 15株加氏乳杆菌菌株的溶血情况

Figure 4. Hemolysis of 15 strains of Lactobacillus gasseri

下载: 全尺寸图片幻灯片

图 5 15株加氏乳杆菌对大肠杆菌ATCC 25922的抑菌情况

Figure 5. Bacteriostasis of 15 strains of Lactobacillus gasseri against E. coli ATCC 25922

下载: 全尺寸图片幻灯片

图 6 15株加氏乳杆菌对金黄色葡萄球菌ATCC 25923的抑制情况

Figure 6. Bacteriostasis of 15 strains of Lactobacillus gasseri on Staphylococcus aureus ATCC 25923

下载: 全尺寸图片幻灯片

表 1 15株加氏乳杆菌生物学特性结果

Table 1. Biological characteristics of 15 strains of Lactobacillus gasseri

菌种编号	形状	颜色	革兰氏染色	七叶苷	棉子糖	蔗糖	麦芽糖	纤维二糖	水杨苷	接触酶	明胶液化	葡萄糖产酸	葡萄糖产气
L. gasseri LGI6-1	杆菌	乳白	G⁺	+	+	+	+	+	+	−	−	+	−
L. gasseri LGI6-2	杆菌	乳白	G⁺	+	+	+	+	+	+	−	−	+	−
L. gasseri LGI6-3	杆菌	半透	G⁺	+	−	+	+	+	+	−	−	+	−
L. gasseri LGI6-4	杆菌	乳白	G⁺	+	−	+	+	+	+	−	−	+	−
L. gasseri LGI6-5	短杆菌	乳白	G⁺	+	−	+	+	+	+	−	−	+	−
L. gasseri LGI6-6	杆菌	乳白	G⁺	+	−	+	+	+	+	−	−	+	−
L. gasseri LGI6-7	杆菌	乳白	G⁺	+	−	+	+	+	+	−	−	+	−
L. gasseri LGI6-8	杆菌	乳白	G⁺	+	−	+	+	+	+	−	−	+	−
L. gasseri LGI6-9	短杆菌	乳白	G⁺	+	+	+	+	+	+	−	−	+	−
L. gasseri LGI6-10	杆菌	乳白	G⁺	+	−	+	+	+	+	−	−	+	−
L. gasseri LGI6-11	杆菌	乳白	G⁺	+	−	+	+	+	+	−	−	+	−
L. gasseri LGI6-12	杆菌	乳白	G⁺	+	+	+	+	+	+	−	−	+	−
L. gasseri LGI6-13	杆菌	乳白	G⁺	+	+	+	+	+	+	−	−	+	−
L. gasseri LGI6-14	杆菌	乳白	G⁺	+	+	+	+	+	+	−	−	+	−
L. gasseri LGI6-15	短杆菌	乳白	G⁺	+	−	+	+	+	+	−	−	+	−
注：“+”表示阳性；“−”表示阴性；“G⁺”表示革兰氏染色呈阳性。

下载: 导出CSV

表 2 15株加氏乳杆菌的溶血情况表

Table 2. Hemolysis of 15 strains of Lactobacillus gasseri

菌种名称	溶血类型（α、β、γ）
L. gasseri LGI 6-1	α
L. gasseri LGI 6-2	α
L. gasseri LGI 6-3	α
L. gasseri LGI 6-4	α
L. gasseri LGI 6-5	γ
L. gasseri LGI 6-6	α
L. gasseri LGI 6-7	γ
L. gasseri LGI 6-8	γ
L. gasseri LGI 6-9	β
L. gasseri LGI 6-10	γ
L. gasseri LGI 6-11	γ
L. gasseri LGI 6-12	γ
L. gasseri LGI 6-13	α
L. gasseri LGI 6-14	α
L. gasseri LGI 6-15	γ
E. faecalis ATCC 29212	γ
S. aureus ATCC 25923	β

下载: 导出CSV

表 3 抗菌药物及药物敏感型标准^[30]

Table 3. Antimicrobial and drug sensitive standards^[30]

抗菌药物类别	药物名称	MIC值判定标准（μg/mL）			质控菌株允许范围（E. faecalis ATCC 29212）
抗菌药物类别	药物名称	S	I	R	质控菌株允许范围（E. faecalis ATCC 29212）
四环素类	四环素	≤4	8	≥16	8~32
碳青霉烯类	亚胺培南	≤4	8	≥16	0.5~2.0
恶唑烷酮类	利奈唑胺	≤2	−	−	1~4
安沙霉素	利福平	≤1	2	≥4	0.5~4.0
糖肽类	万古霉素	≤2	−	−	1~4
叶酸代谢途径抑制剂	甲氧苄啶	≤2	−	≥4	0.12~0.5

下载: 导出CSV

表 4 15株加氏乳杆菌的MIC值及耐药性

Table 4. MIC value and drug resistance of 15 strains of Lactobacillus gasseri

抗生素类别（μg/mL）	LGI6-1	LGI 6-2	LGI6-3	LGI6-4	LGI6-5	LGI6-6	LGI6-7	LGI6-8	LGI6-9	LGI6-10	LGI6-11	LGI6-12	LGI6-13	LGI6-14	LGI6-15
四环素	0.5（S）	<0.125（S）	1（S）	<0.125（S）	1（S）	0.5（S）	2（S）	<0.125（S）	0.125（S）	32（R）	8（R）	0.125（S）	0.125（S）	0.125（S）	0.5（S）
万古霉素	2（S）	2（S）	2（S）	2（S）	4（R）	4（R）	2（S）	2（S）	2（S）	2（S）	2（S）	2（S）	2（S）	4（R）	2（S）
利福平	2（I）	2（I）	2（I）	2（I）	4（R）	4（R）	2（I）	2（I）	2（I）	2（I）	2（I）	2（I）	4（R）	2（I）	4（R）
利奈唑胺	2（S）	2（S）	2（S）	4（R）	2（S）	1（S）	4（R）	1（S）	4（R）	1（S）	1（S）	1（S）	1（S）	1（S）	1（S）
亚胺培南	2（S）	2（S）	2（S）	1（S）	2（S）	2（S）	1（S）	2（S）	1（S）	2（S）	2（S）	2（S）	2（S）	2（S）	4（S）
甲氧苄啶	>4（R）	>4（R）	>4（R）	>4（R）	>4（R）	>4（R）	>4（R）	>4（R）	>4（R）	>4（R）	>4（R）	>4（R）	>4（R）	>4（R）	>4（R）
注：S表示敏感；I表示中敏；R表示耐药。

下载: 导出CSV

表 5 15株加氏乳杆菌抑菌圈直径结果（mm）

Table 5. Results of bacteriostatic circle diameter of 15 strains of Lactobacillus gasseri (mm)

菌种名称	大肠杆菌 ATCC 25922	金黄色葡萄球菌 ATCC 25923
L. gasseri LGI 6-1	10.00±0.10	14.20±0.10
L. gasseri LGI 6-2	16.15±0.05	16.25±0.05
L. gasseri LGI 6-3	10.55±0.50	14.25±0.05
L. gasseri LGI 6-4	15.65±0.15	11.70±0.10
L. gasseri LGI 6-5	10.07±0.70	−
L. gasseri LGI 6-6	11.55±0.45	13.80±0.10
L. gasseri LGI 6-7	16.10±0.60	−
L. gasseri LGI 6-8	−	10.65±0.05
L. gasseri LGI 6-9	10.85±1.95	−
L. gasseri LGI 6-10	−	−
L. gasseri LGI 6-11	15.16±0.30	−
L. gasseri LGI 6-12	−	−
L. gasseri LGI 6-13	−	−
L. gasseri LGI 6-14	14.60±0.50	10.60±0.10
L. gasseri LGI 6-15	10.25±0.15	−
注：“−”表示无抑菌圈。

下载: 导出CSV

参考文献(37)

[1]	VIECO-SAIZ N, BELGUESMIA Y, RASPOET R, et al. Benefits and Inputs from lactic acid bacteria and their bacteriocins as alternatives to antibiotic growth promoters during food-animal production[J]. Front Microbiol,2019,10:57. doi: 10.3389/fmicb.2019.00057
[2]	FRANCL A L, THONGARAM T, MILLER M J. The PTS transporters of Lactobacillus gasseri ATCC 33323[J]. BMC Microbiology,2010,10(1):77. doi: 10.1186/1471-2180-10-77
[3]	闫文杰,段昊,吕燕妮.益生菌在我国保健食品中的应用进展[J].食品工业科技:1−14[2022-06-07]. YAN Wenjie, DUAN Hao, LÜ Yanni. Application progress of probiotics in health food in China[J]. Food Industry Technology: 1−14[2022-06-07]
[4]	GARCIA-GUTIERREZ E, O’CONNOR P M, COLQUHOUN I J, et al. Production of multiple bacteriocins, including the novel bacteriocin gassericin M, by Lactobacillus gasseri LM19, a strain isolated from human milk[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 104, 3869-3884.
[5]	AUTHIER H, SALÓN M L, RAHABI M, et al. Oral administration of Lactobacillus helveticus LA401 and Lactobacillus gasseri LA806 combination attenuates oesophageal and gastrointestinal candidiasis and consequent gut inflammation in mice[J]. Fungi,2021,7:57. doi: 10.3390/jof7010057
[6]	OH N S, JOUNG J Y, LEE J Y, KIM Y. Probiotic and anti-inflammatory potential of Lactobacillus rhamnosus 4B15 and Lactobacillus gasseri 4M13 isolated from infant feces[J]. PLoS One,2018,13(2):e0192021. doi: 10.1371/journal.pone.0192021
[7]	RASTOGI S, MITTAL V, SINGH A. In vitro assessment of antioxidant and antimicrobial potential of Lactobacillus gasseri strains isolated from human milk and infant faeces[J]. Pure Appl Microbiol,2020,14(2):1305−1315. doi: 10.22207/JPAM.14.2.26
[8]	ASLAM B, WANG W, ARSHAD M I, et al. Antibiotic resistance: A rundown of a global crisis[J]. Infection and Drug Resistance,2018,11:1645−1658. doi: 10.2147/IDR.S173867
[9]	GUNYAKTI A, ASAN-OZUSAGLAM M. Lactobacillus gasseri from human milk with probiotic potential and some technological properties[J]. LWT, 2019, 109: 261-269.
[10]	AHIRE J J, SAHOO S, KASHIKAR M S, et al. In vitro assessment of Lactobacillus crispatus UBLCp01, Lactobacillus gasseri UBLG36, and Lactobacillus johnsonii UBLJ01 as a potential vaginal probiotic candidate[J]. Probiotics and Antimicrobial Proteins,2021:1−12.
[11]	周钦育,许喜林,赵珊,等. 婴儿肠道源格氏乳杆菌的安全性评价及益生特性[J]. 食品科学, 2021, 42(16):61−68. ZHOU Qinyu, XU Xilin, ZHAO Shan, et al Safety evaluation and prebiotic characteristics of Lactobacillus Griffiths from infant intestine[J]. Food Science, 2021,42 (16): 61−68.
[12]	ŠPANOVÁ A, DRÁB V, TURKOVÁ K, et al. Selection of potential probiotic Lactobacillus strains of human origin for use in dairy industry[J]. European Food Research and Technology,2015,241(6):861−869. doi: 10.1007/s00217-015-2511-1
[13]	凌代文. 乳酸细菌分类鉴定及实验方法[M]. 北京: 中国轻工业出版社, 1999: 23 LING Daiwen. Classification, identification and experimental methods of lactic acid bacteria[M]. Beijing: China Light Industry Press, 1999: 23
[14]	东秀珠, 蔡妙英. 常见细菌系统鉴定手册[M]. 北京: 北京科学出版社, 2001 DONG Xiuzhu, CAI Miaoying. Manual for system identification of common bacteria[M]. Beijing: Beijing Science Press, 2001
[15]	鲁曦, 马雨哲, 李国花, 等. 健康婴儿粪便样本中罗伊氏乳杆菌的分离鉴定与体外益生特性初步研究[J]. 陕西科技大学学报,2022,40(3):59−65. [LU Xi, MA Yuzhe, LI Guohua, et al. Isolation and identification of Lactobacillus reuteri from fecal samples of healthy infants and preliminary study on its prebiotic properties in vitro[J]. Journal of Shaanxi University of Science and Technology,2022,40(3):59−65. doi: 10.19481/j.cnki.issn2096-398x.2022.03.027
[16]	玛丽娜·库尔曼. 降胆固醇益生菌的筛选鉴定及降血脂功能研究[D]. 哈尔滨: 东北林业大学, 2020. MARINA kurman. Screening and identification of cholesterol lowering probiotics and Study on their lipid lowering function[D]. Harerbin: Northeast Forestry University, 2020.
[17]	尚红, 王毓三, 申子瑜, 等. 全国临床检验操作规程[M]. 人民卫生出版社, 2015 SHANG Hong, WANG Yusan, SHEN Ziyu, et al. National clinical laboratory operating procedures[M]. People's Health Publishing House, 2015
[18]	王志新, 韩烁培, 王雨, 等. 植物乳杆菌的筛选、鉴定及其抑菌物质研究[J]. 食品工业科技,2019,40(9):133−139,146. [WANG Zhixin, HAN Shuopei, WANG Yu, et al. Screening and identification of Lactobacillus plantarum and study on its antibacterial substances[J]. Food Industry Science and Technology,2019,40(9):133−139,146. doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2019.09.024
[19]	李宏伟, 慈百全, 侯明磊, 等. 鸡源乳酸菌的分离鉴定及其生物学特性分析[J]. 江苏农业科学,2020,48(13):188−192. [LI Hongwei, CI Baiquan, HOU Minglei, et al. Isolation, identification and biological characteristics of lactic acid bacteria from chicken[J]. Jiangsu Agricultural Science,2020,48(13):188−192. doi: 10.15889/j.issn.1002-1302.2020.13.038
[20]	KLINGBERG T D, LESNIK U, ARNEBORG N, et al. Comparison of Saccharomyces cerevisiae strains of clinical and nonclinical origin by molecular typing and determination of putative virulence traits[J]. Fems Yeast Res,2008,8:631−640. doi: 10.1111/j.1567-1364.2008.00365.x
[21]	JOINT F A O. WHO working group report on drafting guidelines for the evaluation of probiotics in food[J]. London, Ontario, Canada,2002:30.
[22]	SHARMA P, TOMAR S K, SANGWAN V, et al. Antibiotic resistance of Lactobacillus sp. isolated from commercial probiotic preparations[J]. Journal of Food Safety,2016,36:38−51. doi: 10.1111/jfs.12211
[23]	KIM M J, KU S, KIM S Y, et al. Safety evaluations of Bifidobacterium bifidum BGN4 and Bifidobacterium longum BORI[J]. Int J Mol Sci,2018,19:1422. doi: 10.3390/ijms19051422
[24]	BEECHER D J, SCHOENI J L, WONG A. Enterotoxic activity of hemolysin BL from Bacillus cereus[J]. Infect Immun,1995,63:4423−4428. doi: 10.1128/iai.63.11.4423-4428.1995
[25]	叶露. 加氏乳杆菌JDM511安全性分析[D]. 上海: 上海交通大学, 2014 YE Lu. Safety analysis of Lactobacillus gasseri JDM511[D]. Shanghai Jiaotong University, 2014
[26]	张晓伶. 一株对致病菌有拮抗作用的格氏乳杆菌HMV18的分离鉴定及安全性评价[D]. 石家庄: 河北医科大学, 2020 ZHANG Xiaoling. Isolation, identification and safety evaluation of a Lactobacillus gasseri HMV18 with antagonistic effect on pathogenic bacteria[D]. Shijiazhuang: Hebei Medical University, 2020.
[27]	TEUBER M, MEILE L, SCHWARZ F. Acquired antibiotic resistance in lactic acid bacteria from food[J]. Antonie Van Leeuwenhoek,1999,76(1-4):115−137.
[28]	董沛晶. 微生态制剂的应用研究进展[J]. 现代临床医学, 2017, 43(2): 91−93 DONG Peijing. Research progress in the application of microecological agents[J]. Modern Clinical Medicine, 2017, 43(2): 91−93
[29]	CLSI. 抗菌药物敏感性实验执行标准M100(第30版)[S]. 2020 CLSI. Antimicrobial susceptibility test executive standard M100 (30th Edition)[S]. 2020
[30]	桑佳特, 张瑞, 肖冰冰, 等. 健康女性阴道乳杆菌抑菌功能的初步研究[J]. 现代妇产科进展,2013,22(4):292−296, 301. [SANG Jiate, ZHANG Rui, XIAO Bingbing, et al. A preliminary study on the antibacterial function of Lactobacillus vaginalis in healthy women[J]. Progress in Modern Obstetrics and Gynecology,2013,22(4):292−296, 301. doi: 10.13283/j.cnki.xdfckjz.2013.04.014
[31]	于涛, 姜晓冰, 李磊, 等. 市售酸奶中乳酸菌耐药性及耐药基因的检测[J]. 食品科学, 2016, 37(11):131−136 YU Tao, JIANG Xiaobing, LI Lei, et al. Detection of drug resistance and drug resistance genes of lactic acid bacteria in commercial yoghurt[J]. Food Science, 2016, 37(11): 131−136.
[32]	苏炳森, 操龙斌, 郑介婷, 等. 健康妇女生殖道内格氏乳杆菌的分离鉴定与安全性评价[J]. 南方医科大学报,2021,41(12):1809−1815. [SU Bingsen, CAO Longbin, ZHENG Jieting, et al. Isolation, identification and safety evaluation of Lactobacillus grignai in reproductive tract of healthy women[J]. Journal of Southern Medical University,2021,41(12):1809−1815.
[33]	周兴雅. 格氏乳杆菌与副格氏乳杆菌的筛选、基因组比较及安全性评价[D]. 无锡: 江南大学, 2019 ZHOU Xingya. Screening, genome comparison and safety evaluation of Lactobacillus gasseri and Lactobacillus paragasseri[D]. Wuxi: Jiangnan University, 2019.
[34]	RODRIGUES D A, CUNHA L, FERREIRA C L, et al. Characterization of Lactobacillus gasseri isolates from a breast-fed infant[J]. Gut Microbes,2012,3:15−24. doi: 10.4161/gmic.19489
[35]	刘彩琴, 陆胤, 王石磊, 等. 黄酒米浆水中抗菌乳酸菌的筛选及特性分析[J]. 食品工业科技,2020,41(9):114−118. [LIU Caiqin, LU Yin, WANG Shilei, et al. Screening and characteristic analysis of antibacterial lactic acid bacteria in rice wine and rice slurry[J]. Food Industry Science and Technology,2020,41(9):114−118. doi: 10.13386/jissn1002-0306.2020.09.018
[36]	SHANAHAN F, MCCARTHY J. Functional foods and probiotics time for gastroenterologists to embrace the concept[J]. Cur Gastroenterol Rep,2000,2(5):345−346. doi: 10.1007/s11894-000-0030-z
[37]	肖宏德. 用益生菌制剂代替断奶仔猪日粮中抗生素的实验研究[D]. 武汉: 华中农业大学, 2013 XIAO Hongde. Experimental study on the replacement of antibiotics in the diet of weaned piglets with probiotics[D]. Wuhan: Huazhong Agricultural University, 2013