Effect of Vacuum Heat Treatment and Gluten Gddition on the Gel Properties of Tilapia Myofibrillar Protein
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摘要: 为探索真空热处理与谷蛋白对肌原纤维蛋白（Myofibrillar Protein，MP）凝胶性能的影响，实验以罗非鱼MP为原料，以质构、持水、分子间作用力等为指标研究了真空热处理与谷蛋白添加对罗非鱼MP凝胶的影响。结果表明，在水浴条件下，加入0.7%的谷蛋白显著提高了MP的硬度、凝胶强度。微观结构结果表明谷蛋白使MP凝胶网络趋于平整，孔洞减小，有利于凝胶的形成。与水浴加热相比，经过一段式真空热处理1 h后，MP凝胶的内聚性、弹性、凝胶强度显著提高，真空热处理2 h后，MP凝胶的内聚性与凝胶强度进一步提高。另外，真空热处理和谷蛋白添加改善了MP凝胶的水分状态，T22固定水的含量下降，同时T22固定水与T23自由水的迁移受到限制，使凝胶内水分趋于稳定。分子间作用力结果显示，离子键与疏水相互作用增强，促进了MP的凝胶化。综上所述，真空加工和谷蛋白添加促使MP结构伸展，形成更加致密的三维凝胶网络。Abstract: In order to explore the effects of vacuum heat treatment and gluten on the gel properties of myofibrillar protein (MP), the effects of vacuum heat treatment and gluten addition on tilapia MP gel were studied by testing texture, water retention, intermolecular forces and other indicators. Under the condition of water bath, the addition of 0.7% gluten significantly improved the hardness and gel strength of MP. The microstructure results showed that the gluten made the MP gel network tend to be flat and the holes decreased, which was conducive to the formation of gel. Compared with the water bath heating, the cohesion, elasticity and gel strength of MP gel were significantly improved after 1 h of one-stage vacuum heat treatment. After 2 h of vacuum heat treatment, the cohesion and gel strength of MP gel were further improved. In addition, vacuum heat treatment and gluten addition improved the moisture state of MP gel, the content of T22 fixed water decreased, and the migration of T22 fixed water and T23 free water was restricted, resulting in the stability of the moisture in the gel. The results of intermolecular forces showed that the interaction between ionic bond and hydrophobic interaction was enhanced, which promoted the gelation of MP. In summary, vacuum processing promotes the structure extension of MP and the formation of a more compact three-dimensional gel network.
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Keywords:
- tilapias /
- myofibrillar protein /
- gel /
- vacuum heat treatment /
- gluten
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罗非鱼含有多种人体必须氨基酸和不饱和脂肪酸，被称为“不需要蛋白质的蛋白源”，对健康非常有益[1]。鱼糜制品是原料鱼经取肉、漂洗、脱水、斩拌、热加工得到的凝胶态食品[2−3]，其品质受原料种类、加工方式、添加物等多种因素的影响[4]。肌原纤维蛋白（Myofibrillar Protein，MP）是构成鱼糜凝胶的重要组成部分，探讨不同加工方式对MP凝胶的影响对鱼糜制品的生产发展具有重要意义[5]。
真空加工技术普遍应用于食品生产中，其中真空油炸、微波真空、真空斩拌等技术最为广泛[6]。真空油炸技术是指物料在低氧低温的真空条件下脱水，从而达到改善食品风味及品质的目的[7]，例如一些果蔬脆片等都是通过真空油炸加工制得。与传统油炸技术相比，真空油炸具有风味好、营养成分损失少，油脂氧化慢等特点，体现了真空与油炸技术相结合的优势。微波真空技术集中于微波真空膨化的应用，不仅起到干燥、杀菌的作用，还能较好地保留物料原有的营养成分[8]。真空斩拌技术在面制品及鱼糜凝胶制备的应用较广[9]，能排除面团内多余气体，使蛋白结构发生变化，游离巯基含量下降，α-螺旋和β-折叠结构增加，改善面团的断裂力与色泽[10]。添加蛋白、多糖等物质可以有效改善鱼糜凝胶强调，降低凝胶略变。谷蛋白资源丰富，且富含谷氨酰胺谷氨酰胺（Glutamine，Gln）和半胱氨酸（Cysteine，Cys）。将谷蛋白作为添加物加入到鱼糜中，在谷氨酰胺转氨酶的作用下可以与鱼糜蛋白发生交联，有助于提升鱼糜品质[11]。研究表明，真空能促进谷蛋白分子的交联，形成致密的空间网络[12]，同时真空斩拌能使鱼糜MP的空间结构发生改变，形成较强的凝胶[13]。目前，真空加工研究大多集中于真空油炸、微波真空、真空斩拌等，关于真空结合热处理的研究相对较少。真空热处理能促进蛋白结构的伸展，有利于谷蛋白与罗非鱼MP间的交联[13]。
本研究创新性地将真空热处理和谷蛋白添加应用在罗非鱼MP凝胶中，探索其对罗非鱼MP凝胶质构、水分含量、微观结构、分子间作用力的影响，为后续水产真空加工制品提供相应理论依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
冷冻罗非鱼鱼片 海南翔泰渔业股份有限公司，低温运输至海南大学贮存于−20 ℃备用，；菜籽油 长沙新世纪油脂有限公司；氯化钠 食品级，宁夏夏盛实业集团有限公司；谷蛋白 AR，海南海道森科技有限公司；甲醇、尿素 AR，上海科昌精细化学品公司；双缩脲试剂、亚硝酸钠、无水乙醇 AR，天津市福晨化学试剂厂；硝酸铝、β-巯基乙醇 AR，酷尔化学科技有限公司；氢氧化钠 AR，广州市番禺力强化工厂；三氯乙酸 AR，天津市永大化学试剂有限公司。
TMS-PRO型质构仪 美国FIC公司；T6型紫外分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；FRONTIER型傅里叶变换红外光谱仪 美国PerkinElmer公司；LGJ-12型冷冻干燥机 德国Christ公司；JSM-7610F Plus型扫描电子显微镜 日本日立公司；DC-P3型全自动测色色差计 北京光学仪器厂；HXHW型恒温真空干燥箱 湖南赫西仪器装备有限公司；XⅠR型高速冷冻离心机 赛默飞世尔科技有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 罗非鱼MP的提取
配制低磷酸盐溶液（A液，0.05 mol/L NaCl，3.38 mmol/L NaH2PO4·2H2O，15.5 mmol/L Na2HPO4·12H2O，pH7.5），高磷酸盐溶液（B液，0.6 mol/L NaCl，3.38 mmol/L NaH2PO4·2H2O，15.5 mmol/L Na2HPO4·12H2O，pH7.5）。将冷冻罗非鱼鱼片在室温下缓冻，去除鱼肉表面红肉及筋膜，采用绞肉机将鱼块搅碎至无明显大颗粒。向样品中加入两倍鱼肉重量的A液，搅拌均匀，在4 ℃、4000 r/min条件下离心10 min。离心后去除上层清液再次加入A液。重复上述步骤操作三次。以上操作完成后加入5倍鱼肉重量的B液，搅拌均匀，4 ℃、4000 r/min条件下离心10 min。重复上述步骤操作三次。将最后得到的样品在4 ℃冰箱中静置过夜。在4 ℃、10000 r/min条件下离心10 min，离心后用100目网筛抽滤除筋膜等杂质。在4 ℃冰箱中静置3 h后除去上层清液，将余下样品装入离心管中在10000 r/min、4 ℃条件下离心20 min，去除上清液，得到MP并保存于4 ℃，在24 h内完成检测。用0.6 mol/L NaCl进行十倍稀释后通过Lowry法测定蛋白含量[14]，鉴定提取的MP纯度。
1.2.2 MP凝胶的制备
实验前期对真空热处理加工进行工艺优化，以质构、持水力为指标，通过正交试验得到最佳二段式加热温度和时间；同时，以质构为指标优化了谷蛋白添加比例（0.7%）。表1为MP不同加工处理方式。首先将MP在真空斩拌机中斩拌（4000 r/min），空斩1 min后加入3%的食盐盐擂5 min，随后加入0.7%的谷蛋白擂溃5 min，斩拌过程中温度控制在4 ℃。斩拌好的样品进行真空热加工处理，将样品装入食品袋放进恒温干燥箱内的油锅中，食品袋不封口以便样品处于真空环境。由于水的沸点较低，选择用高沸点的食用油代替水浴。通过前期实验分析得到，与水浴加热相比，油浴加热对MP凝胶的影响并不显著。油浴加热时真空泵持续对恒温干燥箱抽真空，箱内真空度为0.09 MPa，具体处理流程参照表1进行。
表 1 不同处理方法制备的凝胶样品Table 1. Gel samples prepared by different treatment methods处理方法 具体处理流程 WB 先在45 ℃水浴60 min，后在90 ℃中水浴30 min WBG 加入0.7%谷蛋白后，先在45 ℃水浴60 min，后在90 ℃中水浴30 min WB-V1 先在45 ℃油浴真空热处理60 min，后在90 ℃油浴真空热处理30 min WBG-V1 样品加入0.7%谷蛋白后，先在45 ℃油浴真空热处理60 min，后在90 ℃油浴真空热处理30 min WB-V2 先在45 ℃油浴真空热处理120 min，后在90 ℃油浴真空热处理30 min WBG-V2 加入0.7%谷蛋白后，先在45 ℃油浴真空热处理120 min，后在90 ℃油浴真空热处理30 min 1.2.3 纹理轮廓分析（TPA）
将样品切成高15 mm、直径10 mm的圆柱体，间隔时间为2 s，前后速度分别为5.0 mm/s和2.0 mm/s。选取硬度（Hardness），弹性（Springiness），内聚力（Cohesiveness），咀嚼性（Chewiness）分析鱼糜凝胶的TPA值，每个凝胶样品分析6次[3]。
1.2.4 凝胶强度
将样品切成15 mm高的圆柱体，采用P50s球形探头，通过质构仪测定。压缩距离为9 mm，触发力5 g，压缩比45%，测前、测中、测后速度分别为3、1、3 mm/s[3]。
1.2.5 白度测定
将样品切成厚度2 mm的薄片，在室温下采用色差计测定样品的白度。通过标准白板校正，调整参数进行测定[15]。记录L*、a*和b*值。L*代表样品的亮度，a*代表样品偏红，−a*代表样品偏绿，b*代表样品偏黄，−b*代表样品偏蓝。每组测定5个平行样品取平均值。白度（W）采用以下公式计算：
W=100−[(100−L*)2+(a*)2+(b*)2]1/2 (1) 1.2.6 持水力（WHC）的测定
将凝胶样品切成2×2×2 cm3的立方体，用吸水纸吸去样品表面多余的水分，测量样品的重量为W1。样品用三层滤纸包裹均匀，置于50 mL圆形塑料离心管中离心15 min（4 ℃、5000 r/min）[16]，离心后再次将样品称重为W2。每组测试5次。持水力公式计算如下：
WHC(%)=W2W1×100 (2) 式中：WHC表示样品持水力，%；W1表示样品离心前的重量，g；W2表示样品离心后的重量，g。
1.2.7 水分含量测定
将凝胶样品切成厚度为2 mm的薄片，擦去表面多余的水分。水分测定仪预热20 min，取适量滤纸平铺在托盘上，设置时间温度等参数进行统一测定。每组平行测试5次，最终取平均值。
1.2.8 扫描电子显微镜
鱼糜凝胶微观结构的测定参考文献[2]并修改，将样品切成3×2×1 mm3的立方体，在2.5%（w/v）戊二醛溶液中4 ℃固定24 h。样品用80%、90%、100%（v/v）乙醇梯度（15 min/次）脱水[17]，真空冷冻干燥24 h，离子溅射镀金后通过扫描电子显微镜观察。
1.2.9 化学相互作用力的测定
参考文献[18−20]并修改，称取1 g样品，加入10 mL A液，1000 r/min均质30 s后，14000 r/min离心5 min，上清液加入（5 mL）20%三氯乙酸，离心后弃掉上清液。沉淀中加入1 mL 1 mol/L NaOH，4 ℃保存得到S1。取S1的沉淀物，加入10 mL的B液得到S2。取S2的沉淀物，加入10 mL的C液得到S3。取S3的沉淀物，加入10 mL的D液得到S4。取S4沉淀，加入1 mL 1 mol/L NaOH，最终得到S5。离子键（g/L）贡献：溶解在S1中的蛋白质质量分数。如离子键、氢键、疏水相互作用、二硫键、非二硫共价键贡献分别为溶解在S1、S2、S3、S4中的蛋白质的质量分数（g/L）表示。A液为0.6 mol/L NaCl，B液为0.6 mol/L NaCl+1.5 mol/L尿素，C液为0.6 mol/L NaCl+8 mol/L尿素，D液为0.6 mol/L NaCl+8 mol/L尿素+0.5 mol/L β-巯基乙醇。
1.2.10 蛋白溶解度的测定
将2 g鱼糜凝胶样品置于20 mmol/L Tris-HCl缓冲液中均质，缓冲液pH8.0，含1%（w/v）1 g/100 mL SDS，2%（v/v）β-Me，8.0 mol/L尿素[21]。将均质后的样品在100 ℃中加热2 min，磁力搅拌器搅拌4 h后离心。离心条件为10000 r/min、30 min，4 ℃，通过Lowry方法测定蛋白质的含量记为W1。向10 mL上清液中加入5 mL 50%（w/v）三氯乙酸，在4 ℃下放置18 h，同样条件下离心。弃掉上清液后用10%（w/v）TCA冲洗三次，用10 mL 0.5 mol/L NaOH溶解。通过Lowry方法测定蛋白质含量，记为W2。蛋白溶解度公式计算如下：
溶解度=W1W2 (3) 1.3 数据处理
所有实验数据均由IBM SPSS Statistics（SPSS Inc.，Chicago，USA）进行统计分析。采用Origin 2022进行软件绘图。显著性水平（P<0.05）用于确定样本之间的差异，并且显示为平均值±标准偏差（SD）。
2. 结果与分析
2.1 MP质构特性与凝胶强度的变化
由图1A~1E可知，与WB组相比WBG组的硬度、内聚性、凝胶强度均有所改善。其中硬度、凝胶强度显著提高（P<0.05），分别为26.97±0.42 g、1.9±0.07 g·mm，与WB组相比分别增加了6.59%、18.75%，而咀嚼性与弹性显著下降（P<0.05）。根据相关研究表明[22]，谷蛋白含有的Gln能在酶的作用下与MP相互作用，促进蛋白分子间的交联，达到增强MP凝胶强度的目的。硬度是指凝胶样品发生形变时被压缩的最大力[23]，MP随着加热时间的延长，发生变性聚集形成硬度较大的凝胶。谷蛋白填充在凝胶网络中进一步提高了样品的最大压缩力，因此MP的硬度、凝胶强度都显著提高（P<0.05）。MP凝胶的弹性与自由水的含量及流动强弱密切相关，同时与肌动球蛋白与肌球蛋白的热稳定性具有显著相关性[24]。与WB相比，WBG组的弹性显著下降（P<0.05），表明谷蛋白添加可能对MP凝胶的水分含量及蛋白的热稳定性产生一定影响。
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热处理主要是将MP从溶胶转变成凝胶的过程，MP中蛋白的种类、结构与外部加工条件等都会影响该过程的形成[8]。由图1A~1E可知，与WB相比，WB-V1的内聚性、弹性、凝胶强度明显提高，分别为0.67±0.03、15.11±0.17、2.1±0.05 g·mm，与WB组相比分别增加了8.06%、19.29%、31.25%，硬度与咀嚼性显著降低了23.32%、6.32%（P<0.05）。与WB相比，WB-V2的内聚性、弹性、凝胶强度均明显提高，分别为0.7±0.01、14.36±0.27、2.6±0.12 g·mm，硬度与咀嚼性显著降低了19.24%、1.81%（P<0.05）。与水浴加热相比，真空热处理能显著提高MP凝胶的内聚性、弹性、凝胶强度，MP在真空环境下进一步伸展，蛋白间形成有序交联，在同样的加热温度下形成更加致密的凝胶网络。真空能减少凝胶内孔洞的形成，使其形成更加均匀有序的凝胶网络，与微观结构结果一致。同时真空排除了大量的气体抑制了凝胶内二硫键的形成，更多的疏水基团显现蛋白间的相互作用增强，从而MP的内聚性、凝胶强度提高。真空降低了MP凝胶内水分含量，增大了凝胶密度，凝胶弹性有所改善[25]。与真空热处理1 h相比，经过2 h加工处理后的MP凝胶强度、硬度、咀嚼性显著提高（P<0.05），弹性显著下降（P<0.05），可能是长时间的真空热处理使肌动球蛋白与肌球蛋白的热稳定性发生改变，蛋白从溶胶到凝胶的过程受到影响，进而影响凝胶弹性的变化。
由图1A~1E可以看出，与WB组相比，WBG-V1的弹性、凝胶强度显著提高（P<0.05），分别为13.36±0.47 mm、2.2±0.08 g·mm，与WB组相比分别提高了5.47%、37.5%，内聚性变化不显著（P>0.05），硬度与咀嚼性显著下降（P<0.05），分别降低了14.1%、5.32%。真空使MP变性伸展，谷蛋白与MP间进一步交联，凝胶内部的水分含量及存在状态发生改变，弹性、凝胶强度显著提高（P<0.05）。同时真空1 h加工处理降低了MP凝胶的最大压缩力与咀嚼性，可能与MP凝胶网络结构有关。与WB-V1组相比，WBG-V1的硬度、咀嚼性、凝胶强度提高了12.01%、1.07%、4.76%，弹性降低了11.58%，表明谷蛋白能在真空热处理条件下进一步改善MP质构特性。与WB组相比，WBG-V2组的内聚性、咀嚼性、弹性、凝胶强度显著提高（P<0.05），分别提高了20.97%、4.14%、17.66%、56.25%。与WB-V2组相比，WBG-V2组的硬度、咀嚼性、弹性显著提高（P<0.05）。谷蛋白中含有大量的Gln和Cys[26]，在真空2 h加工条件下，谷蛋白变性伸展相关基团暴露，与MP进一步交联形成更加稳定的网络结构，改善凝胶特性。
2.2 MP凝胶白度的变化
从图2A中可以看出，与WB组相比WBG组的白度（73.5±1.16）下降了3.94%。谷蛋白呈淡黄色，而MP白度相对较高，导致WBG组白度呈下降趋势。与水浴加热相比，MP凝胶经过真空处理后白度显著下降（P<0.05），分别降低了2.67%、5.30%、3.78%、8.25%。真空加工可降低蛋白凝胶中氧气含量，抑制脂肪与肌红蛋白的氧化[6]，影响MP的红度（a*）与黄度（b*）。此外，真空热处理后凝胶内水分含量下降，凝胶表面质子密度降低导致光反射效果减弱[27]，影响了MP凝胶白度。与WB-V1和WB-V2相比，WBG-V1与WBG-V2的白度进一步降低，主要受谷蛋白的呈色影响。
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图 2 真空热处理对添加谷蛋白罗非鱼MP白度及持水力的影响Figure 2. Effects of vacuum heat treatment on MP whiteness and water retention of gluten-added tilapia2.3 MP凝胶持水力的变化
从图2B中可以看出，与WB组相比WBG组的持水力显著提高（P<0.05），一方面是谷蛋白填充在MP的凝胶孔洞后限制了凝胶内水分的移动，与MP质构结果一致；另一方面，谷蛋白吸收MP凝胶内部的水分，经热处理后凝胶的持水力提高[28]。与WB组相比，WB-V1与WB-V2的持水力分别增加了22.96%、25.52%，WBG-V1与WBG-V2的持水力增加了16.33%、17.36%。可能是真空热处理促进了凝胶中蛋白间与蛋白内的化学相互作用，形成的凝胶网络致密有序捕获了更多的水分[29]。加入谷蛋白后，真空加工后的MP凝胶持水力显著下降（P<0.05），可能是谷蛋白内部暴露的疏水基团与MP相互作用，导致凝胶持水力下降[29]。真空热处理和谷蛋白添加均有助于提高MP的持水力，而真空热处理比真空热处理协同谷蛋白添加对MP的持水力效果更好。
2.4 MP水分含量的变化
如图3所示，与WB相比，WBG组的水分含量略有下降但并不显著（P>0.05），WB-V1、WBG-V1、WB-V2与WBG-V2的水分含量显著下降（P<0.05），分别降低了10.15%、11.71%、11.50%、12.18%。与WB-V1、WBG-V1相比，WB-V2、WBG-V2组的水分含量没有显著变化（P>0.05），MP凝胶的水分含量随真空时间延长而趋于平稳。真空处理增强了蛋白与水的相互作用，形成了更致密的网络空间，降低了MP凝胶内固定水与自由水含量[12]。
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图 3 真空热处理对添加谷蛋白罗非鱼MP水分含量的影响Figure 3. Effect of vacuum heat treatment on moisture content of MP in gluten-added tilapia2.5 MP凝胶微观结构
由图4b可以看出，在水浴加热条件下谷蛋白添加降低了MP凝胶团块的形成且孔隙逐渐变小[30]。图4c~f可以看出，与WB相比WB-V1表面趋于平整，MP间相互交联形成的凝胶紧密有序。与WB-V1相比，WBG-V1组的凝胶表面产生了较小孔洞且结构相对粗糙，在1 h真空加工条件下谷蛋白的伸展有限进而影响了蛋白间的交联。与WBG-V1相比，WBG-V2的微观结构更加致密均匀，表明真空处理2 h进一步促进了谷蛋白与MP的相互作用，蛋白聚集形成均匀有序的凝胶网络，与MP凝胶质构结果一致。
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图 4 真空热处理对添加谷蛋白罗非鱼MP扫描电镜的影响注：a~f依次为WB、WBG、WB-V1、WBG-V1、WB-V2、WBG-V2组。Figure 4. Effect of vacuum heat treatment on scanning electron microscope of MP in tilapia added with gluten2.6 MP凝胶化学作用力
化学作用力对维持MP凝胶具有重要作用，主要包括氢键、离子键、疏水相互作用、二硫键、非二硫共价键等[31−32]。不同的外源添加物、加热方式都会影响化学作用力的形成。
2.6.1 氢键
如图5所示，与WB相比，WBG组氢键含量增加1.79%，表明谷蛋白的添加有利于MP凝胶内氢键的形成。与WB相比，WB-V1（P<0.05）、WBG-V1、WB-V2（P<0.05）与WBG-V2（P<0.05）氢键含量降低，分别下降了2.71%、1.44%、4.62%、4.34%，可能是真空处理影响了凝胶内蛋白结构与水分含量，氨基酸的疏水性与电荷频率发生变化，氢键的形成受到抑制[33]。与WB-V1、WB-V2相比，WBG-V1、WBG-V2的含量略有增加但并不显著（P>0.05），这是MP与谷蛋白内的亚基形成氢键的结果[34]。与WB-V1、WBG-V1相比，WB-V2、WBG-V2氢键含量显著下降（P<0.05），在2 h真空条件下，蛋白进一步变性聚集影响了凝胶氢键的形成。
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图 5 真空热处理对添加谷蛋白罗非鱼MP氢键的影响Figure 5. Effect of vacuum heat treatment on hydrogen bond of MP in gluten-added tilapia2.6.2 离子键
如图6所示，与WB相比，WBG、WB-V1、WBG-V1、WB-V2与WBG-V2离子键含量显著提高（P<0.05），分别增加了6.14%、13.75%、10.19%、22.33%、24.73%，真空热处理有利于MP离子键的形成，可能与MP的进一步变性聚集有关。与WB-V1、WBG-V1相比，WB-V2、WBG-V2离子键含量增加，可能是长时间真空处理促进了鱼糜凝胶内原肌球蛋白、肌动蛋白的结构舒展，增加了离子键含量[18]。谷蛋白的添加增加了WBG和WBG-V2的离子键，但对WBG-V1显示出一定的降低作用，推测加热方式和处理时间可能是导致离子键差异的主要原因。
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图 6 真空热处理对添加谷蛋白罗非鱼MP离子键的影响Figure 6. Effect of vacuum heat treatment on ionic bond of MP in tilapia added with gluten2.6.3 疏水相互作用
疏水相互作用是维持MP凝胶的主要作用力，有利于稳定蛋白构象[35]。如图7所示，与WB相比，WBG的疏水性提高了6.14%，谷蛋白加入改善了MP的疏水相互作用促进其凝胶形成。与WB相比，WB-V1、WBG-V1、WB-V2与WBG-V2的疏水性相互作用显著提高（P<0.05）。在真空热处理条件下，MP内部更多的疏水性氨基酸与非极性多肽暴露在表面，有利于凝胶疏水作用力的形成[36]。进一步解释了真空能够促使MP结构的展开，蛋白间相互聚集形成更加有序规则的凝胶网络。
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图 7 真空热处理对添加谷蛋白罗非鱼MP疏水相互作用的影响Figure 7. Effect of vacuum heat treatment on hydrophobic interaction of MP in gluten-added tilapia2.6.4 二硫键
由图8可以看出，与WB相比WBG、WB-V1、WBG-V1、WB-V2与WBG-V2的二硫键含量略有下降但并不显著（P>0.05）。真空热处理使蛋白变性伸展疏水性增加，隐藏的巯基暴露影响凝胶内二硫键的形成。同时真空热处理会降低凝胶内部氧气的含量，蛋白巯基的氧化程度也会影响二硫键的形成[6]。
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图 8 真空热处理对添加谷蛋白罗非鱼MP二硫键的影响Figure 8. Effect of vacuum heat treatment on MP disulfide bond of gluten-added tilapia2.6.5 非二硫共价键
非二硫共价键主要指凝胶内ε-（γ-Glu）-Lys的含量，通过转谷氨酰胺酶催化形成[26]。由图9可以看出，不同加工条件对非二硫共价键的影响较小。加入谷蛋白后共价键略有提高但并不显著（P>0.05），谷蛋白含有大量的Gln和Cys，在酶的催化下与MP相互交联形成一定数量的ε-（γ-Glu）-Lys键[26]。
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图 9 真空热处理对添加谷蛋白罗非鱼MP非二硫共价键的影响Figure 9. Effect of vacuum heat treatment on non-disulfide covalent bond of gluten-free tilapia MP2.7 MP凝胶溶解度
溶解度反映了凝胶内蛋白变性程度[37]，试剂（尿素、SDS和β-巯基乙醇等）的混合物不能破坏ε-（γ-Glu）-Lys共价键但可以破坏非二硫共价键[10]，当凝胶内此共价键较多时溶解度呈下降趋势[38]。由图10可以看出，在水浴加热条件下加入谷蛋白后溶解度略有下降但并不显著（P>0.05），表明谷蛋白主要填充在MP凝胶网络中，进一步解释了同条件下MP质构的变化规律。与WB相比，WB-V1、WBG-V1、WB-V2与WBG-V2溶解度显著下降（P<0.05），分别降低了22.19%、23.23%、27.10%、25.49%。真空使蛋白变性伸展相关基团暴露交联，非二硫共价键含量有轻微的增加，凝胶溶解度下降[39]。同时，TGase是影响该共价键形成的重要因素，真空处理可能对该酶的活性产生影响，进而影响该共价键的形成。与WB-V1、WBG-V1相比，WB-V2与WBG-V2溶解度进一步降低但并不显著（P>0.05），表明在2 h真空条件下蛋白间的聚集增强。综上所述，真空热处理有利于MP与谷蛋白的聚集凝胶。
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图 10 真空热处理对添加谷蛋白罗非鱼MP溶解度的影响Figure 10. Effect of vacuum heat treatment on solubility of MP of tilapia added with gluten3. 结论
本研究探讨了六种不同加工方式对罗非鱼MP凝胶特性的影响。结果表明，在水浴加热条件下，0.7%谷蛋白可以显著提高MP的硬度与凝胶强度。与水浴加热相比，经过真空热处理的MP凝胶其弹性、凝胶强度显著提高。经过一段式真空热处理2 h的MP凝胶加入谷蛋白后其内聚性、咀嚼性、弹性、凝胶强度显著提高。真空热处理与谷蛋白添加使MP凝胶白度下降、持水力显著提高。在真空条件下，凝胶内水分含量下降，疏水相互作用与离子键含量显著增加。微观结构表明，在水浴加热条件下MP凝胶表面粗糙杂乱，整体凝胶的交联度较差，真空热加工促进了MP与谷蛋白充分交联形成更加致密均匀的凝胶网络。综上所述，真空热处理与谷蛋白添加对MP凝胶产生积极影响，为水产鱼糜制品的开发提供理论参考。
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图 2 真空热处理对添加谷蛋白罗非鱼MP白度及持水力的影响
Figure 2. Effects of vacuum heat treatment on MP whiteness and water retention of gluten-added tilapia
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图 3 真空热处理对添加谷蛋白罗非鱼MP水分含量的影响
Figure 3. Effect of vacuum heat treatment on moisture content of MP in gluten-added tilapia
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图 4 真空热处理对添加谷蛋白罗非鱼MP扫描电镜的影响
注：a~f依次为WB、WBG、WB-V1、WBG-V1、WB-V2、WBG-V2组。
Figure 4. Effect of vacuum heat treatment on scanning electron microscope of MP in tilapia added with gluten
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图 5 真空热处理对添加谷蛋白罗非鱼MP氢键的影响
Figure 5. Effect of vacuum heat treatment on hydrogen bond of MP in gluten-added tilapia
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图 6 真空热处理对添加谷蛋白罗非鱼MP离子键的影响
Figure 6. Effect of vacuum heat treatment on ionic bond of MP in tilapia added with gluten
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图 7 真空热处理对添加谷蛋白罗非鱼MP疏水相互作用的影响
Figure 7. Effect of vacuum heat treatment on hydrophobic interaction of MP in gluten-added tilapia
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图 8 真空热处理对添加谷蛋白罗非鱼MP二硫键的影响
Figure 8. Effect of vacuum heat treatment on MP disulfide bond of gluten-added tilapia
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图 9 真空热处理对添加谷蛋白罗非鱼MP非二硫共价键的影响
Figure 9. Effect of vacuum heat treatment on non-disulfide covalent bond of gluten-free tilapia MP
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图 10 真空热处理对添加谷蛋白罗非鱼MP溶解度的影响
Figure 10. Effect of vacuum heat treatment on solubility of MP of tilapia added with gluten
表 1 不同处理方法制备的凝胶样品
Table 1 Gel samples prepared by different treatment methods
处理方法 具体处理流程 WB 先在45 ℃水浴60 min，后在90 ℃中水浴30 min WBG 加入0.7%谷蛋白后，先在45 ℃水浴60 min，后在90 ℃中水浴30 min WB-V1 先在45 ℃油浴真空热处理60 min，后在90 ℃油浴真空热处理30 min WBG-V1 样品加入0.7%谷蛋白后，先在45 ℃油浴真空热处理60 min，后在90 ℃油浴真空热处理30 min WB-V2 先在45 ℃油浴真空热处理120 min，后在90 ℃油浴真空热处理30 min WBG-V2 加入0.7%谷蛋白后，先在45 ℃油浴真空热处理120 min，后在90 ℃油浴真空热处理30 min 
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