Preparation, Purification, Identification and Anti-lipid Oxidation of Kidney Bean Skin Polyphenols
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摘要: 为了探究紫花芸豆皮多酚的制备纯化工艺及抗油脂氧化作用，本研究以紫花芸豆皮为原料，采用单因素实验考察了提取溶剂浓度、提取温度、提取时间、料液比和提取次数对芸豆皮多酚提取量的影响；利用HPD600大孔树脂对芸豆皮多酚粗提液进行了纯化，并采用液相色谱质谱联用仪分析酚类物质组成；以过氧化值为指标利用Arrhenius方程建立花生油的货架期预测模型。结果表明，乙醇浓度60%、提取温度70 ℃、提取时间40 min、液料比1:60（g:mL）、提取次数4次为芸豆皮多酚的最佳提取条件，此时芸豆皮多酚提取量为0.18±0.49 g/g；HPD600大孔树脂对紫花芸豆皮多酚的静态吸附容量、解吸率最大，适合分离纯化紫花芸豆皮多酚，最佳纯化工艺为上样流速1.0 mL/min、洗脱剂乙醇浓度60%和洗脱流速1.0 mL/min，此时芸豆皮多酚纯度为54.68%±1.97%；芸豆皮中含有19种单体酚，其中儿茶素含量最高，为425.952±7.652 µg/g；添加芸豆皮多酚或抗氧化剂能有效延缓食用油过氧化值升高，通过模型推算多酚-维生素C复配的花生油在20 ℃条件下的货架期最长可达193.4 d，对照组货架期为150.3 d，与实测值最大相对误差为8.7%，可准确预测该食用油的货架期。综上，芸豆皮多酚具有较强的抗氧化性，具有安全的天然食品抗氧化剂的潜在用途。Abstract: In order to explore the preparation and purification process of polyphenols from purple flower kidney bean skins and their anti-lipid oxidation effect, this study investigated the effects of solvent concentration, extraction temperature, extraction time, solid-liquid ratio and number of extraction on extraction amount of polyphenols from purple flower kidney bean skins by single factor experiments. Purified the crude extraction with HPD600 macroporous resin, and analyzed the phenolic composition using liquid chromatography-mass spectrometer. Shelf life predication model of peanut oil was established with peroxide value as the indicator using the Arrhenius equation. The experimental results showed that the optimal extraction conditions for kidney bean skin polyphenols were: ethanol concentration of 60%, extraction temperature of 70 ℃, extraction time of 40 min, solid-to-liquid ratio of 1:60 (g:mL), and 4 times of extraction, under these conditions, the extraction amount of polyphenols was 0.18±0.49 g/g. HPD600 had the highest static adsorption capacity and desorption rate, making it suitable for purifying polyphenols from purple kidney bean skins. The optimal purification conditions were: loading flow rate of 1.0 mL/min, ethanol concentration of 60%, elution flow rate of 1.0 mL/min, and the maximum purity of polyphenols was 54.68%±1.97%. Kidney bean skins contained 19 types of monomer phenols, with the highest catechin content at 425.952±7.652 µg/g. Adding kidney bean skin polyphenols or antioxidants could effectively delay the increase in peroxide value of edible oil. Using a model, it was calculated that peanut oil mixed with polyphenols-vitamin C had a maximum shelf life of 193.4 d at 20 ℃, control group was 150.3 d, with a maximum relative error of 8.7% compared to measured values, accurately predicting the shelf life of the edible oil. In conclusion, kidney bean skin polyphenols had strong antioxidant properties and potential as a safe natural food antioxidant.
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芸豆学名菜豆（Phaseolus vulgaris L.），起源于中南美洲和安第斯山脉一带，从16世纪末，中国逐步成为芸豆次级发源地和发展中心[1]。芸豆具有药食同源的功效，富含多种营养成分，如蛋白质、膳食纤维、酚类化合物、维生素和微量元素等[2]，在预防慢性非传染疾病和改善人体健康方面发挥重要作用，也是制作糕点、豆馅、甜汤、豆沙的优质原料。芸豆皮是包裹在芸豆仁外的一层表皮，占全豆颗粒质量的7.5%～8.0%，含有丰富的酚类化合物、膳食纤维等多种生物活性物质。在芸豆加工过程中，如生产高品质芸豆沙为提高豆制品的口感，芸豆皮经常作为加工副产物而被去除，造成一定程度的资源浪费。
多酚是芳环上含有一个或多个羟基的化合物，普遍存在于不同植物组织中的次生代谢产物，多酚作为一种天然的活性物质具有抗氧化、降血糖、降血脂、降压抗癌、保护肝脏及调节机体免疫力等功能[3−4]。Gan等[5]的研究结果表明，豆类豆皮中多酚含量与其抗氧化能力呈显著正相关，有色豆类豆皮具有比大多数普通水果、蔬菜、食用真菌和谷物更高的抗氧化效果；抗氧化成分可以延缓油脂氧化，延长油脂货架期，目前常用于油脂抗氧化的主要是化学合成抗氧化剂，如叔丁基对苯二酚（TBHQ）和2,6-二叔丁基对甲酚（BHT）等，虽然它们对于提高油脂稳定性具有显著的效果，但其本身具有一定毒性，长期食用会对机体产生不良反应[6]。多酚作为一种天然植物提取物，其酚羟基可以通过提供还原性氢与脂过氧化自由基反应，将自由基转化为非自由基产物，使自由基无法进一步氧化不饱和脂肪酸终止氧化链式反应从而实现减缓脂质氧化速度的目的[7−8]。试验研究表明，植物多酚不仅对油脂具有较好的抗氧化作用，并且抗氧化剂之间的复配能够起到协调增效作用[9]。
为此，本研究选取紫花芸豆皮为原料，利用有机溶剂提取多酚，采用液相色谱质谱联用（Liquid Chromatography-mass Spectrometry，HPLC-MS）对大孔树脂纯化后的多酚进行成分分析，依据过氧化值（Peroxide Value，POV）指标评价多酚对食用油的抗氧化性并预测货架期，以期探究芸豆皮多酚作为天然抗氧化剂应用到油脂中的潜力，为芸豆皮的综合加工利用提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
紫花芸豆 于2021年10月购自内蒙古的新鲜紫花芸豆；菜籽油、大豆油、花生油 购自黑龙江省大庆市农贸市场；无水乙醇、无水碳酸钠、没食子酸、抗坏血酸、过硫酸钾、石油醚、冰乙酸、碘化钾 辽宁泉瑞试剂有限公司；异丙醇 天津市富宇精细化工有限公司；硫代硫酸钠、福林酚 上海麦克林生化公司；三氯甲烷 天津市科密欧化学试剂有限公司；所有分离用有机溶剂均为国产分析纯。
HY-08高速粉碎机 北京环亚天元机械技术有限公司；SHA-B恒温振荡器 力辰科技有限公司；5417R离心机 日本国茨城县常陆那珂市；U-2910紫外可见分光光度计 日立高新技术公司；Vanquish超高效液相色谱-质谱联用仪（配有电喷雾离子源（ESI），利用软件TraceFinder处理数据） 美国Thermo公司。
1.2 实验方法
1.2.1 紫花芸豆皮多酚粗提物的提取流程
紫花芸豆→清洗→浸泡→去胚→烘干至恒重→粉碎（过80目筛）→乙醇溶液提取→离心（5000 r/min）→合并上清液→旋转蒸发浓缩→冷冻干燥至粉末状，4 ℃冷藏备用。
1.2.2 单因素实验
参考Chu等[10]的方法，并略加修改。固定初始参数为乙醇浓度60%、恒温水浴温度50 ℃、浸提时间30 min、料液比 1:50（g:mL）、提取次数4次。探究不同乙醇浓度（40%、50%、60%、70%和80%），恒温水浴温度（30、40、50、60、70和80 ℃），浸提时间（10、20、30、40和50 min），料液比（1:20、1:30、1:40、1:50、1:60、1:70和1:80（g:mL）），提取次数（2、3、4、5和6次）对芸豆皮多酚提取量的影响。
1.2.3 多酚提取量测定
多酚提取量的测定根据Bouslamti等[11]的方法，以没食子酸标准曲线y=1.2825x+0.0821，R²=0.9979计算多酚提取量。
多酚提取量(mg/g)=C×V×Nm 式中：C表示根据吸光度值计算出的溶液质量浓度，mg/mL；N表示溶液稀释倍数；V表示供试品溶液体积，mL；m表示芸豆皮干粉取样量，g。
1.2.4 芸豆皮多酚的纯化
1.2.4.1 大孔树脂静态吸附试验
参考Sun等[12]的方法，取预处理的AB-8、D101、HPD100、HPD400和HPD6000大孔树脂于锥形瓶中，加入100 mL芸豆皮多酚粗提液，吸附与解吸完成后按下式计算树脂的吸附容量和解析率。综合考虑上述两个指标，筛选出适合纯化芸豆皮多酚的大孔树脂进一步研究。
Q=(C0−C1)×V1M D=C2×V2M×Q×100 式中：Q表示吸附容量，mg/g；C0表示样品溶液初始浓度，mg/mL；C1表示平衡浓度，mg/mL；V1表示吸附溶液体积，mL；D表示解吸率，%；C2表示解吸液浓度，mg/mL；V2表示解吸液体积，mL；M表示大孔树脂质量，g。
1.2.4.2 大孔树脂动态吸附试验
通过5种大孔树脂对芸豆皮多酚的静态吸附试验，对筛选出的一种树脂进行动态吸附试验。采用湿法将活化好的大孔树脂装入内径1.5×30 cm的层析柱中，芸豆皮多酚溶液上柱吸附，控制上样流速，分步收集流出液绘制泄露曲线。待吸附完成后用大量去离子水洗去树脂表面未被完全吸附的样品，控制乙醇溶液浓度，分步收集流出液绘制洗脱曲线，同时研究不同上样流速（0.25、0.5、1.0、1.5和2.0 mL/min）、洗脱流速（0.25、0.5、1.0、1.5和2.0 mL/min）、洗脱液浓度（20%、40%、60%和80%乙醇洗脱液）对大孔树脂吸附容量与解吸率的影响[13]。
1.2.5 HPLC-MS分析芸豆皮多酚的组成成分
称取100 mg纯化后的冷冻干燥样品，加入500 μL 80%甲醇水溶液（含0.2%维生素C），涡旋混匀，室温超声30 min，于12000 r/min离心10 min，取上清液稀释，采用Vanquish超高压液相色谱仪和Q Exactive质谱仪对芸豆皮多酚类化合物进行结构和含量鉴定。
色谱参数：Waters HSS T3（50×2.1 mm，1.8 μm）色谱柱，柱温40 ℃，流速0.3 mL/min，进样量2 µL；流动相A：0.1%乙酸水溶液，B：0.1%乙酸乙腈溶液。洗脱梯度：0.00~6.00 min，90%A；6.00~8.00 min 40%A；8.00~12.00 min 90%A。
质谱条件：采用电喷雾离子源（Electrospray ionization，ESI），离子喷雾电压−2800 V，温度350 ℃，离子传输管温度320 ℃，采用的扫描模式为单离子检测（SIM）模式，扫描方式为负离子，精确一级扫描范围（m/z）：100~900。利用软件TraceFinder处理质谱数据，通过质谱仪精确测定的分子离子或碎片离子的质量，依靠计算机计算出化合物的组成，实现多酚类化合物的定性。定量主要是利用不同浓度的标准品，以标准品的浓度为横坐标，以标准品的峰面积为纵坐标作图，从而获得靶向化合物与其峰面积的数学关系（线性、二次方程、对数等），进而根据未知样品中相应化合物的峰面积计算其浓度。
1.2.6 多酚抗油脂氧化试验
采用烘箱贮藏法测定芸豆皮多酚抗油脂氧化性[14]。参考Loskutova等[15]的方法，分别取100 g食用油加入0.02%芸豆皮多酚、二丁基羟基苯酚（BHT）、特丁基对苯二酚（TBHQ）和维生素C，定期测定食用油POV值，同时测定多酚与多酚-抗氧化剂复配对食用油脂的抗氧化作用。
1.2.7 油脂货架期的预测
1.2.7.1 过氧化值指数回归方程的建立
称取一定量花生油分别置于4±1、60±1和70±1 ℃的恒温条件下，每6 d测定一次POV值，30 d后对各温度下花生油的过氧化值指数回归，得到油脂过氧化值与时间的关系式和反应速率常数[16]。
1.2.7.2 食用油氧化的阿伦尼乌斯直线绘制
食用油的货架期主要由氧化反应速率和时间决定，通常以20 ℃时的POV为评价指标，阿伦尼乌斯方程进行了定量分析[17]，公式如下：
k=AeE/RT 式中：k为速率常数；R为气体常量，J/（mol·K）；T为绝对温度，K；E为表观活化能，J/mol；A为前因子。
对数形式的阿伦尼乌斯方程反映了速度常数ln（k）与温度1/T的关系，若二者呈线性相关，表明该食用油的品质变化遵循一阶动力学方程，可以计算货架期。
1.2.7.3 货架期预测
油脂在加工、储藏等过程中，其品质变化符合一级反应动力学模型，该模型反映了油脂过氧化值在不同温度下达到临界值所需时间[18]，公式如下：
Pt=P0ekt 式中：Pt为食用油在第t d时的过氧化值，meq/kg；P0为食用油初始的过氧化值，meq/kg；k为速率常数；t为食用油存储时间，d。
1.3 数据处理
所有实验均重复三次，结果以平均值±标准差表示；实验数据的统计分析采用SPSS 19.0软件（P<0.05，差异显著），并用Origin 2021和excel作图。
2. 结果与分析
2.1 提取工艺对多酚提取量的影响
本研究以多酚提取率为指标，考察乙醇浓度、温度、时间、料液比、提取次数等因素对芸豆皮多酚提取率的影响，结果如图1所示。由图1A可知，多酚提取量随乙醇浓度的升高先增大后减小（P<0.05），在60%时达到最大，当乙醇浓度过高时反应体系极性变弱，化学键在弱极性环境断裂困难，还会增大杂质、亲脂性物质的溶解，这些物质阻碍了多酚与乙醇-水分子的结合导致提取量减小[19−20]。由图1B可知，多酚提取量随提取温度的升高先增大后减小（P<0.05），在70 ℃时达到最大，这是由于温度升高，分子热运动速度加快并且细胞壁的渗透性增加，但温度过高会导致多酚与某些活性成分反应从而影响其分子结构，同时导致的溶剂蒸发也会引起多酚的提取量下降[21]。由图1C可知，多酚提取量在提取时间为40 min时达到最大值，适当增加提取时间有利于多酚的释放，但时间过长会使多酚氧化分解从而影响多酚提取[22]。由图1D可知，多酚提取量随料液比的增加显著增大（P<0.05），在1:60时达到最大值，当溶剂用量增加到一定程度，多酚的溶出逐渐达到上限并趋于平缓。由图1E可知，多酚提取量随提取次数的增加显著增大（P<0.05），在提取4次时达到最大值，随后趋于稳定，这主要是由于随着提取次数增加溶解的多酚越多，当多酚被全部提取出来时，即使增加提取次数，多酚变化量不显著。综上所述，本实验最佳提取条件为：乙醇浓度60%、提取温度70 ℃、料液比1:60（g:mL），提取时间40 min和提取次数4次，此时多酚提取量为0.18±0.49 g/g。
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图 1 各单因素对紫花芸豆皮多酚提取量的影响注：A：乙醇浓度；B：提取温度；C：提取时间；D：料液比；E：提取次数；不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。Figure 1. Effect of each single factor on the extraction amount of polyphenols from purple kidney bean skin2.2 大孔树脂吸附试验
2.2.1 静态吸附试验结果
本研究以吸附容量和解吸率为指标，进行芸豆皮多酚的静态吸附试验，结果如表1所示。由表1可知，HPD600树脂对芸豆皮多酚的吸附容量最大可达30.662±0.574 mg/g，其次分别为AB-8、D101、HPD400、HPD100；HPD600的解吸率最高为99.457%±0.588%，其次分别为AB-8、D101、HPD400、HPD100。选择适合纯化芸豆皮多酚的树脂不仅要求吸附容量高，其解吸率也要高。树脂的吸附与解吸率不仅同极性、比表面积、平均孔径有关等物理性能有关，还与样品性质有关。综合考虑，本文选择吸附容量和解吸率最高的HPD600树脂进行芸豆皮多酚的分离纯化，并进一步研究其吸附特性。
表 1 5种大孔树脂的基本性能参数和静态吸附特性Table 1. Basic performance parameters and static adsorption characteristics of 5 macroporous resins树脂种类 比表面积（m2/g） 平均孔径（A°） 极性 水分含量（%） 吸附容量（mg/g） 解吸率（%） AB-8 480~520 130~140 弱极性 65~75 26.992±0.552ab 98.924±0.782a D101 500~550 90~100 非极性 70.5 23.791±1.397b 96.729±1.341ab HPD100 650~700 85~90 非极性 65~75 23.044±0.847b 74.259±2.559c HPD400 550~600 90~100 中极性 65~75 23.471±0.416b 94.704±2.171b HPD600 550~600 80 极性 65~75 30.662±0.574a 99.457±0.588a 注：同一列不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。 2.2.2 动态吸附试验结果
本研究以上样流速、洗脱剂浓度、洗脱流速为考察因素，进行芸豆皮多酚的动态吸附试验，结果如图2所示。由图2可知，随着上样量增加，流出液中多酚的含量逐渐增大，第22管的多酚含量（0.057 mg/mL）达到了样品原液中总多酚含量的10%，此时已经发生泄漏（图2A）；洗脱的多酚几乎全部集中在2~7管（共180 mL）中，第7管以后的洗出液中多酚含量非常低，这表明洗脱液用量不应少于210 mL（图2C）；当乙醇浓度为60%和80%时，氢键的断裂作用增强，多酚易被洗脱下来[23−25]（图2D）。吸附容量和解吸率随上样流速和洗脱流速的增加呈先平缓后降低的趋势（P<0.05），综合试验周期、成本等因素最佳纯化条件为：上样量为220 mL、上样流速1.0 mL/min、洗脱液用量为210 mL、洗脱剂乙醇浓度60%、洗脱流速1.0 mL/min，此时多酚纯度为54.68%±1.97%。
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图 2 各单因素对紫花芸豆皮多酚动态吸附与解吸性能的影响注：A：大孔树脂吸附芸豆皮粗多酚的泄漏曲线，B：上样流速对大孔树脂柱吸附容量的影响，C：芸豆皮粗多酚的洗脱曲线，D：乙醇浓度对大孔树脂解吸效果的影响，E：洗脱液流速对大孔树脂解吸效果的影响；不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。Figure 2. Effect of each single factor on the dynamic adsorption and desorption properties of purple flower kidney bean skin polyphenols2.3 酚酸组成成分及含量分析
采用HPLC-MS法对芸豆皮多酚成分和含量进行了鉴定，结果如图3、表2所示。芸豆皮游离多酚中共检测出19种酚酸，包括没食子酸、水杨酸、儿茶素、苯丙氨酸等，其中儿茶素含量最高（425.952±7.652 µg/g），原儿茶醛（34.815±0.717 µg/g）和原儿茶酸（24.848±0.252 µg/g）次之。儿茶素含量明显高于其他多酚含量，占总含量的76.1%（m/m）。
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图 3 紫花芸豆皮多酚样品总离子流图Figure 3. Total ion flow plot of polyphenol sample from purple flower kidney bean skin表 2 芸豆皮多酚各组分的分析结果Table 2. Analysis results of polyphenol components in kidney bean skin组别 保留时间（min） 标准曲线 决定系数 含量（µg/g） 没食子酸 0.990 Y=3.827e3X 0.9998 0.534 苯丙氨酸 1.090 Y=6.573e4X 0.9984 1.847 原儿茶酸 1.830 Y=1.261e5X 0.9999 24.848 原儿茶醛 3.110 Y=2.001e5X 0.9992 34.815 4-羟基苯甲酸 3.290 Y=2.089e5X 0.9999 13.728 儿茶素 3.870 Y=1.479e5X 0.9997 425.952 香草酸 4.080 Y=1.468e5X 0.9991 0.320 咖啡酸 4.240 Y=1.908e5X 0.9997 2.315 丁香酸 4.460 Y=1.432e5X 0.9989 0.203 表儿茶素 4.740 Y=1.742e5X 0.9998 18.870 香草醛 5.060 Y=1.513e5X 0.9997 0.862 对香豆酸 5.240 Y=6.891e4X 0.9984 5.530 丁香醛 5.410 Y=2.164e5X 0.9994 0.203 水杨酸 5.500 Y=4.181e5X 0.9999 0.318 反式阿魏酸 5.600 Y=1.191e5X 0.9972 21.811 芥子酸 5.660 Y=1.727e5X 0.9968 6.081 苯甲酸 5.940 Y=8.989e4X 0.9974 0.515 羟化肉桂酸 7.070 Y=1.19e5X 0.9987 0.0132 反式肉桂酸 7.170 Y=1.014e5X 0.9982 0.727 2.4 芸豆皮多酚的抗油脂氧化作用
本研究以菜籽油、花生油、大豆油的过氧化值为指标，进行芸豆皮多酚的抗油脂氧化试验，结果如图4所示。由图4A~C可知，三种食用油的POV值随贮存时间延长呈上升的趋势，添加芸豆皮多酚、BHT、THQ和维生素C的食用油POV值显著低于对照组，其中化学抗氧化剂TBHQ的抗氧化效果最好，这主要是由于多酚或化学抗氧化剂可以与活性氧结合，清除体内过量的自由基，从而达到抗油脂氧化的作用[26−28]，与菜籽油和大豆油相比，花生油各对照组在第18 d前后的POV值已陆续达到临界值（≤19.7 meq/kg）；由图4D~F可知多酚与抗氧化剂协同使用后，三种食用油的POV值均未达到临界值且POV值最大为10.0 meq/kg，较单一使用抗氧化剂的抗油脂氧化作用效果明显，可有效延缓食用油POV的增加，这种增效作用分析主要是由于各抗氧化剂发挥作用后会生成的游离基团，相互作用生成了新化合物同样可以延缓食用油氧化，故而提高了抗氧化效果[29−30]。由于在储存30 d时未添加抗氧化剂的花生油的POV值可达60 meq/kg，变化明显且远高于菜籽油和大豆油，所以选择花生油做进一步的货架期预测。
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图 4 不同抗氧化剂和芸豆皮多酚-抗氧化剂复配对食用油POV的影响注：A~C：芸豆皮多酚与单一抗氧化剂对油脂POV值的影响；D~F：芸豆皮多酚协同其他抗氧化剂对油脂POV值的影响。Figure 4. Effect of different antioxidants and kidney bean skin polyphenols-antioxidant joint treatment on edible oil POV2.5 食用油货架期的预测
2.5.1 对花生油货架期寿命的影响
根据贮藏过程中油脂过氧化值测定结果发现油脂过氧化值随贮藏时间的延长变化较为显著，且规律较明显，所以采用一级反应动力学模型来描述花生油过氧化值的变化。
2.5.1.1 建立过氧化值指数回归方程
不同温度下花生油过氧化值随时间的变化如图5所示，将具体的参数统计如表3所示。从表3可知，随着温度的升高，花生油的氧化速度常数增加，同时氧化程度也随之升高；4、60和70 ℃温度的回归系数分别为 0.9902、0.9925、0.9911均呈显著性相关，从而证实了花生油的过氧化值与时间的变化趋势符合一级反应动力学模型。
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图 5 不同温度下花生油过氧化值的指数回归图Figure 5. Exponential regression diagram of peroxidation value of peanut oil at different temperatures表 3 花生油在不同温度下的过氧化反应方程及参数Table 3. Peroxidation reaction equations and parameters of peanut oil at different temperatures温度（T） 回归方程 反应速率常数（k） 回归系数 显著性 4 ℃（277.15 K） y=2.081e0.0072x 0.0072 R2=0.9902 P<0.05 60 ℃（333.15 K） y=1.8739e0.0573x 0.0573 R2=0.9925 P<0.05 70 ℃（343.15 K） y=2.6832e0.1059x 0.1059 R2=0.9911 P<0.05 2.5.1.2 阿伦尼乌斯直线的绘制及货架期预测
由公式可知，E为常量，以1/T作为自变量，ln（k）为函数作图，可得到花生油的阿伦尼乌斯直线如图6所示。
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图 6 反应速率常数与贮藏温度的线性回归分析Figure 6. Linear regression analysis of the reaction rate constant and the storage temperature从图6可以看出，ln（k）和1/T具有良好的线性关系，由此可以计算出活化能E，带入温度参数即可得到该温度下的反应速度，从而预测出花生油在20 ℃时的货架寿命，结果见表4。从表4可知，花生油在20 ℃的贮藏条件下预测的货架期为150.3 d。
表 4 不同温度下花生油货架期预测Table 4. Predicted shelf life for peanut oil at different temperatures温度（T） 反应速率常数（k） P0（meq/kg） P（meq/kg） 货架期（d） 70 ℃（343.15 K） 0.1298 2.3741 19.7 16.3 20 ℃（293.15 K） 0.0141 2.3741 19.7 150.3 2.5.2 添加芸豆皮多酚或抗氧化剂对花生油货架期寿命的影响
脂肪过氧化反应越快，其反应速率常数k值越大。本研究以过氧化值为指标进行花生油货架期预测，结果如图7、表5所示。由表5可知，20 ℃下花生油（已开封）空白对照组的货架寿命为150.3 d，添加BHT、TBHQ和维生素C均有延长花生油货架寿命的效果，其中添加TBHQ的花生油在20 ℃货架期最长，为162.0 d；多酚与抗氧化剂的复合作用均能显著延长花生油的货架寿命，多酚和维生素C复配后花生油在20 ℃货架期最长，为193.4 d，比单一使用抗氧化剂效果好。食品中添加过量的BHT、TBHQ会产生一定的毒副作用，其限量不得超过0.02%[31]，由于芸豆皮多酚是天然植物中安全无毒的醇提抗氧化成分，因此，在生产实践中，可通过适当增加提取物的用量，使其具有与化学合成类抗氧化剂相当的抗油脂氧化能力。
表 5 添加多酚和抗氧化剂的花生油过氧化反应参数及货架期预测Table 5. Peroxidation parameters and shelf life prediction of peanut oil extracts with polyphenols and antioxidants提取物/
抗氧化剂反应速率
常数（k）P0
（meq/kg）P
（meq/kg）花生油货架期
预测（d）70±1 ℃ 20 ℃ 0%提取物 0.1298 2.3741 19.7 16.3 150.3 0.02%提取物 0.1245 2.3741 19.7 16.9 151.9 0.02% BHT 0.134 2.3741 19.7 15.8 154.9 0.02% TBHQ 0.123 2.3741 19.7 17.2 162.0 0.02% VC 0.1211 2.3741 19.7 17.4 153.3 提取物+BHT 0.0538 2.3741 19.7 39.3 190.5 提取+TBHQ 0.0538 2.3741 19.7 39.3 190.6 提取物+VC 0.0509 2.3741 19.7 41.6 193.4 ![]()
图 7 花生油的过氧化值指数回归图注：A：多酚和抗氧化剂单独处理；B：多酚-抗氧化剂复合处理。Figure 7. Exponential regression plot of the peroxide values for peanut oil2.5.3 添加芸豆皮多酚和抗氧化剂的花生油理论货架期验证
为验证该模型准确性，对不同温度下花生油货架期的预测值与实测值进行比较，如表6所示。
表 6 不同贮藏温度下添加多酚和抗氧化剂的花生油理论货架期验证Table 6. Validation of theoretical shelf life of peanut oil supplemented with polyphenols and antioxidants at different storage temperatures提取物/
抗氧化剂花生油货架期
预测值（d）花生油货架期
实测值（d）花生油相对
误差（%）70±1 ℃ 20 ℃ 70±1 ℃ 20 ℃ 70±1 ℃ 20 ℃ 0%提取物 16.3 150.3 16.0 139.0 1.8 8.1 0.02%提取物 16.9 151.9 16.0 141.0 5.6 7.3 0.02% BHT 15.8 154.9 15.0 144.0 5.3 7.6 0.02% TBHQ 17.2 162.0 17.0 152.0 1.2 6.6 0.02% VC 17.4 153.3 17.0 141.0 2.4 8.7 提取物+BHT 39.3 190.5 38.0 177.0 3.4 7.6 提取物+TBHQ 39.3 190.6 37.0 176.0 6.2 8.3 提取物+VC 41.6 193.4 40.0 179.0 4.0 7.4 注：相对误差（%）=（花生油货架期预测值−花生油货架期实测值）/花生油货架期实测值×100。 由表6可知，本研究建立的花生油货架期预测值与花生油货架期实测值的最大相对误差为8.7%，误差较小，因此该模型较可靠，能够较好的预测花生油的货架期。
3. 结论
紫花芸豆皮多酚的最佳提取工艺为：乙醇浓度60%、提取温度70 ℃、时间40 min、料液比1:60（g:mL）、提取次数4次，在该提取条件下多酚提取量为0.18±0.49 g/g。利用HPD600大孔树脂对芸豆皮多酚粗提液的最佳纯化工艺为：上样量220 mL，上样流速1 mL/min，洗脱用量大于180 mL，洗脱剂60%乙醇溶液，洗脱流速1 mL/min，纯化后多酚纯度可达54.68%±1.97%，回收率为32.1%±2.45%；抗油脂氧化试验表明，芸豆皮多酚对油脂氧化的抑制效果较为明显，且与TBHQ、BHT和维生素C存在协同增效作用，建立的花生油货架期模型符合一级反应动力学，经预测花生油在20 ℃下货架期最长为193.4 d，是空白组的1.29倍。本研究表明芸豆皮多酚可作为天然绿色食品抗氧化剂应用到食品中，有助于延长油脂货架期，下一步将结合酸价、碘值等指标对抗油脂氧化进行综合分析，为天然抗氧化剂及芸豆皮的综合利用提供理论依据。
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图 1 各单因素对紫花芸豆皮多酚提取量的影响
注：A：乙醇浓度；B：提取温度；C：提取时间；D：料液比；E：提取次数；不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。
Figure 1. Effect of each single factor on the extraction amount of polyphenols from purple kidney bean skin
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图 2 各单因素对紫花芸豆皮多酚动态吸附与解吸性能的影响
注：A：大孔树脂吸附芸豆皮粗多酚的泄漏曲线，B：上样流速对大孔树脂柱吸附容量的影响，C：芸豆皮粗多酚的洗脱曲线，D：乙醇浓度对大孔树脂解吸效果的影响，E：洗脱液流速对大孔树脂解吸效果的影响；不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。
Figure 2. Effect of each single factor on the dynamic adsorption and desorption properties of purple flower kidney bean skin polyphenols
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图 3 紫花芸豆皮多酚样品总离子流图
Figure 3. Total ion flow plot of polyphenol sample from purple flower kidney bean skin
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图 4 不同抗氧化剂和芸豆皮多酚-抗氧化剂复配对食用油POV的影响
注：A~C：芸豆皮多酚与单一抗氧化剂对油脂POV值的影响；D~F：芸豆皮多酚协同其他抗氧化剂对油脂POV值的影响。
Figure 4. Effect of different antioxidants and kidney bean skin polyphenols-antioxidant joint treatment on edible oil POV
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图 5 不同温度下花生油过氧化值的指数回归图
Figure 5. Exponential regression diagram of peroxidation value of peanut oil at different temperatures
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图 6 反应速率常数与贮藏温度的线性回归分析
Figure 6. Linear regression analysis of the reaction rate constant and the storage temperature
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图 7 花生油的过氧化值指数回归图
注：A：多酚和抗氧化剂单独处理；B：多酚-抗氧化剂复合处理。
Figure 7. Exponential regression plot of the peroxide values for peanut oil
表 1 5种大孔树脂的基本性能参数和静态吸附特性
Table 1 Basic performance parameters and static adsorption characteristics of 5 macroporous resins
树脂种类 比表面积（m2/g） 平均孔径（A°） 极性 水分含量（%） 吸附容量（mg/g） 解吸率（%） AB-8 480~520 130~140 弱极性 65~75 26.992±0.552ab 98.924±0.782a D101 500~550 90~100 非极性 70.5 23.791±1.397b 96.729±1.341ab HPD100 650~700 85~90 非极性 65~75 23.044±0.847b 74.259±2.559c HPD400 550~600 90~100 中极性 65~75 23.471±0.416b 94.704±2.171b HPD600 550~600 80 极性 65~75 30.662±0.574a 99.457±0.588a 注：同一列不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。 
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表 2 芸豆皮多酚各组分的分析结果
Table 2 Analysis results of polyphenol components in kidney bean skin
组别 保留时间（min） 标准曲线 决定系数 含量（µg/g） 没食子酸 0.990 Y=3.827e3X 0.9998 0.534 苯丙氨酸 1.090 Y=6.573e4X 0.9984 1.847 原儿茶酸 1.830 Y=1.261e5X 0.9999 24.848 原儿茶醛 3.110 Y=2.001e5X 0.9992 34.815 4-羟基苯甲酸 3.290 Y=2.089e5X 0.9999 13.728 儿茶素 3.870 Y=1.479e5X 0.9997 425.952 香草酸 4.080 Y=1.468e5X 0.9991 0.320 咖啡酸 4.240 Y=1.908e5X 0.9997 2.315 丁香酸 4.460 Y=1.432e5X 0.9989 0.203 表儿茶素 4.740 Y=1.742e5X 0.9998 18.870 香草醛 5.060 Y=1.513e5X 0.9997 0.862 对香豆酸 5.240 Y=6.891e4X 0.9984 5.530 丁香醛 5.410 Y=2.164e5X 0.9994 0.203 水杨酸 5.500 Y=4.181e5X 0.9999 0.318 反式阿魏酸 5.600 Y=1.191e5X 0.9972 21.811 芥子酸 5.660 Y=1.727e5X 0.9968 6.081 苯甲酸 5.940 Y=8.989e4X 0.9974 0.515 羟化肉桂酸 7.070 Y=1.19e5X 0.9987 0.0132 反式肉桂酸 7.170 Y=1.014e5X 0.9982 0.727
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表 3 花生油在不同温度下的过氧化反应方程及参数
Table 3 Peroxidation reaction equations and parameters of peanut oil at different temperatures
温度（T） 回归方程 反应速率常数（k） 回归系数 显著性 4 ℃（277.15 K） y=2.081e0.0072x 0.0072 R2=0.9902 P<0.05 60 ℃（333.15 K） y=1.8739e0.0573x 0.0573 R2=0.9925 P<0.05 70 ℃（343.15 K） y=2.6832e0.1059x 0.1059 R2=0.9911 P<0.05
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表 4 不同温度下花生油货架期预测
Table 4 Predicted shelf life for peanut oil at different temperatures
温度（T） 反应速率常数（k） P0（meq/kg） P（meq/kg） 货架期（d） 70 ℃（343.15 K） 0.1298 2.3741 19.7 16.3 20 ℃（293.15 K） 0.0141 2.3741 19.7 150.3
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表 5 添加多酚和抗氧化剂的花生油过氧化反应参数及货架期预测
Table 5 Peroxidation parameters and shelf life prediction of peanut oil extracts with polyphenols and antioxidants
提取物/
抗氧化剂反应速率
常数（k）P0
（meq/kg）P
（meq/kg）花生油货架期
预测（d）70±1 ℃ 20 ℃ 0%提取物 0.1298 2.3741 19.7 16.3 150.3 0.02%提取物 0.1245 2.3741 19.7 16.9 151.9 0.02% BHT 0.134 2.3741 19.7 15.8 154.9 0.02% TBHQ 0.123 2.3741 19.7 17.2 162.0 0.02% VC 0.1211 2.3741 19.7 17.4 153.3 提取物+BHT 0.0538 2.3741 19.7 39.3 190.5 提取+TBHQ 0.0538 2.3741 19.7 39.3 190.6 提取物+VC 0.0509 2.3741 19.7 41.6 193.4
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表 6 不同贮藏温度下添加多酚和抗氧化剂的花生油理论货架期验证
Table 6 Validation of theoretical shelf life of peanut oil supplemented with polyphenols and antioxidants at different storage temperatures
提取物/
抗氧化剂花生油货架期
预测值（d）花生油货架期
实测值（d）花生油相对
误差（%）70±1 ℃ 20 ℃ 70±1 ℃ 20 ℃ 70±1 ℃ 20 ℃ 0%提取物 16.3 150.3 16.0 139.0 1.8 8.1 0.02%提取物 16.9 151.9 16.0 141.0 5.6 7.3 0.02% BHT 15.8 154.9 15.0 144.0 5.3 7.6 0.02% TBHQ 17.2 162.0 17.0 152.0 1.2 6.6 0.02% VC 17.4 153.3 17.0 141.0 2.4 8.7 提取物+BHT 39.3 190.5 38.0 177.0 3.4 7.6 提取物+TBHQ 39.3 190.6 37.0 176.0 6.2 8.3 提取物+VC 41.6 193.4 40.0 179.0 4.0 7.4 注：相对误差（%）=（花生油货架期预测值−花生油货架期实测值）/花生油货架期实测值×100。
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