Process Exploration and Flavor Analysis of Oyster Enzymatic Hydrolysates by Lactiplantibacillus pentosus Fermentation
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摘要: 为了探究添加戊糖乳杆菌（Lactiplantibacillus pentosus）发酵牡蛎酶解液对蚝汁品质和风味的影响，本文首先确定了适合蚝汁加工的牡蛎品种并建立了蚝汁专属感官描述词库，后以氨基酸态氮含量和感官评分为指标，确定了发酵菌种、发酵温度、发酵时间、接种量和调味的工艺参数，并对未发酵、发酵后牡蛎酶解液和调味发酵牡蛎酶解液进行了游离氨基酸、挥发性化合物和感官品质的分析。结果表明，乳山牡蛎（Crassostrea gigas）为蚝汁加工适用品种；当戊糖乳杆菌接种量为7%、发酵温度为37 ℃、发酵时间为3 h时，牡蛎酶解液中氨基酸态氮含量最高，整体风味协调性最好；当发酵牡蛎酶解液中葡萄糖添加量为8%、食盐添加量为2%时进行短时高温高压（100 kPa、121 ℃、20 min）处理，并将体积浓缩为原来的50%后感官品质提升，此时调味发酵牡蛎酶解液的氨基酸态氮含量为1.06±0.03 g/100 g。发酵使牡蛎酶解液鲜甜味氨基酸含量显著上升（P<0.05），苦味氨基酸含量显著下降（P<0.05），发酵和调味处理可降低牡蛎酶解液中己醛、1-戊烯-3-醇、3-甲基丁醛和（E,E）-2,4-庚二烯醛等腥味物质的含量，增加具有焙烤香味的吡嗪等香气愉悦的挥发性化合物，有效改善牡蛎酶解液的风味。总之，戊糖乳杆菌发酵有利于提高牡蛎酶解液品质，为蚝汁加工工艺改进提供了新思路。Abstract: In order to investigate the effects of fermented oyster enzymatic hydrolysates on the quality of oyster juice, this study firstly identified oyster species suitable for the processing of oyster juice and established an exclusive sensory descriptive library for oyster juice. And then, through single-factor experimental analysis based on sensory scores and amino acid nitrogen content, the optimal fermentation conditions were determined. The free amino acids, volatile flavor components, and sensory properties were compared between unfermented oyster hydrolysates, fermented oyster hydrolysates, and seasoning fermented oyster hydrolysates. The results showed that Rushan oysters (Crassostrea gigas) were selected for oyster juice processing and an exclusive sensory descriptive library was developed. Lactiplantibacillus pentosus was vaccinate as the fermenting agent. Optimum fermentation condition was at 37 ℃ with the inoculum of 7% for 3 h. Under the optimized conditions, both the amino nitrogen content and flavor were significantly improved. The optimal flavoring conditions for the fermented oyster hydrolysates involved high temperature and pressure treatment (100 kPa, 121 ℃, 20 min) with 8% glucose addition and 2% salt addition, followed by volume concentration to 50% of the original. These conditions resulted in further enhancement of amino nitrogen content with the content of 1.06±0.03 g/100 g and aroma. Additionally, fermentation led to a significant increase (P<0.05) in umami and sweet amino acids, while the content of bitter amino acids decreased significantly (P<0.05). Moreover, the fermented and seasoned treatments effectively reduced the presence of undesirable volatile compound s such as hexanal, 1-penten-3-ol, 3-methylbutanal, and (E,E)-2,4-heptadienal in the oyster hydrolysate, while the level of pleasant compounds was increased such as pyrazine (desirable baking odor). In conclusion, Lactiplantibacillus pentosus fermentation proved to be beneficial in improving the quality of oyster hydrolysates, providing novel insights for the enhancement of oyster juice processing techniques.
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Keywords:
- oyster /
- fermentation /
- enzymatic hydrolysates /
- oyster juice /
- flavor
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牡蛎是我国重要的海洋生物资源，据《2023中国渔业统计年鉴》统计[1]，我国牡蛎养殖量为620万吨，约占全球养殖总产量的80%。蚝油是牡蛎高值化利用的重要途径之一，利用牡蛎提取物制备出的高档风味调味料备受青睐[2]。原蚝汁是生产蚝油的主体和主要原料，是蚝香的重要来源，然而蚝汁传统煮制工艺制取原蚝汁的方法存在成本高、蚝肉煮制残渣资源浪费、煮制条件不可控、风味损失等诸多问题[3]。因此，改进蚝汁加工工艺以提高牡蛎利用率和蚝汁品质成为亟待解决的问题。
随着现代化生物加工技术的进步，通过酶解法制备调味料逐渐成为研究热点[4−5]。尽管酶解是一种有效的原料制备方法，但是牡蛎酶解通常会伴有异味和苦味[6]，限制酶解牡蛎相关产业的发展。生物发酵技术是改善水产品品质和风味的有效方法之一[7]，这为牡蛎酶解蚝汁的制备提供了新的选择。戊糖乳杆菌（Lactiplantibacillus pentosus）作为一种功能性益生菌，常存在于在发酵水产品中，该菌不仅具有降低胆固醇和提高的作用[7−8]，还可产生发酵特有怡人香气[9]。GAO等[9]利用戊糖乳杆菌发酵鱼骨酶解产物，减少了酶解过程产生的异味和苦味氨基酸的含量，同时增加了醇类、酯类和酸类等发酵特有愉悦气味，提高氨基氮含量水平。实验室前期成功从牡蛎中分离纯化出戊糖乳杆菌，该菌在本体牡蛎酶解液中可能生长适应性更佳而具有更好的发酵性能，但是目前还未有研究评估戊糖乳杆菌发酵对牡蛎酶解液的影响。
除了酶解和发酵等过程，调味、浓缩等加工过程对蚝汁的品质和感官特性亦有很大影响。添加食盐和还原糖是对产品进行调味的常用方式，安全性高且易被消费者接受。食盐可以促进风味化合物的释放[10]并且可以延长蚝汁等产品的货架期，浓缩处理可以达到目标预期的品质；还原糖与牡蛎酶解产物在高温条件下发生美拉德反应可以改善酶解液风味和色泽状态[11]，使之更接近蚝汁。发酵后通常需要灭菌、灭酶处理，这一步骤所需的短时高温高压（121 ℃、100 kPa、20 min）不仅能满足美拉德反应所需温度时间，与蚝汁传统蒸煮工艺相比更节约时间。然而，发酵牡蛎酶解产物条件控制、菌种选择、风味改善、氨基酸态氮（Amino Acid Nitrogen，AAN）含量提升、调味方式等方面的工艺研究较少，并且缺少蚝汁专用感官描述词库与感知定性定量标准，限制了发酵在蚝汁制备方面的应用。
因此，本研究以改进蚝汁加工工艺为目标，首先鉴定南北方牡蛎原料对加工蚝汁的适用性，然后基于感官组学建立蚝汁专用感官描述词库作为评价蚝汁的标准，再探究发酵牡蛎酶解的适宜条件和调味最佳水平，采用感官评价、气相色谱-离子迁移谱（Gas Chromatography Ion Mobility Spectrometry, GC-IMS）、游离氨基酸分析对发酵牡蛎酶解液从气味与滋味两个方面揭示蚝汁呈香与呈味属性的形成与变化规律，旨在探究发酵酶解工艺对蚝汁工艺改进的可行性。本研究结果将为实现牡蛎全利用及蚝汁减损增鲜协同效果、促进蚝油加工业转型升级提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
新鲜带壳乳山牡蛎（Crassostrea gigas） 购买于青岛当地海鲜市场；新鲜带壳漳州牡蛎（Crassostrea gigas） 网购于京东生鲜；复合动物蛋白酶（由风味蛋白酶、内切酶、外切酶复合而成的中性蛋白酶，酶活为105 U/g） 广西东恒华道酶制剂公司；四种不同香气类型浓缩蚝汁 网购于京东商城；戊糖乳杆菌（Lactiplantibacillus pentosus）、植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、赤霞酵母（Kazachstania menglunensis） 均为本实验室从牡蛎中分离，现保藏于武汉市武昌区八一路武汉大学中国典型培养物保藏中心；氢氧化钠标准滴定液 阿拉丁试剂（上海）有限公司；甲醛（36%~38%）、氯化钠（AR）、硫酸铜（AR）、硫酸钾（AR）、硫酸（AR）、硼酸（AR）、甲基红（GR）、溴甲酚绿（GR）、乙酸镁（AR）、石油醚（AR） 国药集团化学试剂有限公司；MRS培养基、营养琼脂培养基、YPDA培养基 青岛海博生物技术有限公司；食盐、葡萄糖 佳禾食品工业股份有限公司；肝/肌糖原比色法测定试剂盒 南京建成生物工程研究所；其他化学试剂均为分析纯。
LA-8080全自动氨基酸分析仪 日本日立HITACHI公司；FlavourSpec气相离子迁移谱联用仪 德国G.A.S仪器有限公司；GL-21M型高速冷冻离心机 湘仪离心机仪器有限公司；PURELAB Classic超纯水机 北京龙跃伟逸科贸有限公司；THZ-312振荡培养箱、DHG-9036A电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司；8400全自动凯式定氮仪 瑞典福斯公司；YXQ-75SII高压灭菌锅 上海博迅医疗生物仪器股份有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 乳山牡蛎、漳州牡蛎营养成分测定
蛋白含量按GB 5009.5-2016凯氏定氮法测定[12]；水分按GB 5009.3-2016直接干燥法测定[13]；脂肪按GB 5009.6-2016索氏抽提法测定[14]；灰分按GB 5009.4-2016食品中总灰分测定[15]；糖原测定使用肝/肌糖原测定试剂盒。
1.2.2 蚝汁专用感官描述词库建立
感官评价小组成员由实验室的10名训练有素的成员（5男5女，年龄在21~28岁）组成。在实验前，每个小组成员在两周内完成不同香气类型的浓缩蚝汁的感官评价训练。将10 mL蚝汁样品置于50 mL密闭离心管使香气平衡24 h，将每个样品编码后随机提供给小组成员。参考ISO 13299-2016《感官分析 方法学 建立感官剖面的导则》利用自由选择剖面法（Free Choice Profile, FCP），要求感官评价小组成员尽可能多地自由地记录下感官描述词来描述他们所感知到的风味，保证每个感官评价成员在记录时独立自主、无相互交流。再利用快速感官分析法（Check-All-That-Apply, CATA），将FCP获得的感官描述词进行汇总，对感官描述词进行随机排序并制作调查问卷进行多项选择，要求感官评价成员选择符合蚝汁感官的描述词，筛选出选择次数大于三次的描述词形成蚝汁感官描述词库。
1.2.3 牡蛎酶解液制备
参考南富心等[16]的方法。新鲜牡蛎去壳洗净后打浆，料液比为1:3（w:v），用高速均质分散机进行分散混匀，按蛋白含量的0.3%添加复合动物蛋白酶，pH维持自然条件（pH约为6.5~7.0），50 ℃酶解4 h后于沸水浴中灭酶10 min，冷却至室温后备用。
1.2.4 发酵菌种的培养和筛选
戊糖乳杆菌和植物乳杆菌在MRS琼脂培养基中以37 ℃培养24 h，挑取单菌落于MRS肉汤培养基进行传代，酿酒酵母和赤霞酵母在营养琼脂培养基中以28 ℃培养24 h，挑取单菌落于YPDA培养基进行传代，培养12 h后进行第二次传代，传代结束后在4 ℃以10000 r/min离心15 min收集菌体，用无菌生理盐水稀释成108~109 CFU/mL的菌悬液，用于酶解液接种。固定酵母菌发酵温度28 ℃，乳酸菌发酵温度37 ℃，接种量7%，发酵时间6 h，考察戊糖乳杆菌、植物乳杆菌、酿酒酵母和赤霞酵母对牡蛎酶解液感官和AAN含量的影响。
1.2.5 发酵提质增鲜工艺单因素实验
为探究菌发酵对牡蛎酶解液脱腥和品质提升的最优工艺条件，根据产业化实际需求结合相关文献支持，最终确定以感官评分和AAN含量为评价指标进行对牡蛎酶解液发酵工艺的优化。以1.2.3制备的新鲜酶解液，采用上述筛选出的戊糖乳杆菌进行发酵，固定发酵时间6 h，接种量7%，考察发酵温度（30、33、37、39、41、45 ℃）对牡蛎酶解液提质脱腥效果的影响；固定发酵温度37 ℃，接种量7%，考察发酵时间（0、3、6、9、12、24 h）对牡蛎酶解液提质脱腥效果的影响；固定发酵温度37 ℃，发酵时间3 h，考察接种量（0%、6%、7%、8%、9%、10%）对牡蛎酶解液提质脱腥效果的影响。
1.2.6 发酵牡蛎酶解液调配工艺单因素实验
工艺流程：发酵牡蛎酶解液→添加糖、盐→短时高温高压→浓缩。
通过添加葡萄糖、食盐、短时高温高压（100 kPa、121 ℃、20 min）后浓缩，进一步改善发酵牡蛎酶解液的风味并提高AAN含量，以AAN含量和感官评分为评价指标对调配比例进行工艺优化。在上述优化得到的发酵牡蛎酶解液未浓缩的情况下，固定食盐添加量1%，考察添加不同含量葡萄糖（0%、4%、8%、12%、16%）后短时间高温高压反应，对发酵牡蛎酶解液风味优化效果和AAN含量的影响；固定葡萄糖添加量8%，考察添加不同食盐量（0%、2%、4%、6%、8%）后短时间高温高压反应，对发酵牡蛎酶解液风味优化效果和AAN含量的影响；确定葡萄糖和食盐添加量并进行短时高温高压后，根据AAN含量和感官评分对样液进行浓缩倍数（90%、80%、70%、60%、50%）的优化。
1.2.7 感官评定
10位品评员对不同发酵条件牡蛎酶解液的气味、滋味、色泽、体态进行评分，取平均值作为感官评价得分。具体感官评价标准见表1。
表 1 蚝汁感官评价标准Table 1. Sensory evaluation standards for oyster juice项目 风味名称 风味描述 感官评分
（分）气味
（40分）鲜牡蛎肉特征香气
（8分）牡蛎肉特征香气浓郁，怡人 8 牡蛎肉特征香气较明显，易察觉 7 牡蛎肉特征香气一般，可察觉 5~6 牡蛎肉特征香气较淡，不易察觉 3~4 无牡蛎肉特征香气 1~2 熟蚝香气
（8分）煮熟牡蛎特征香气浓郁，怡人 8 煮熟牡蛎特征香气较明显，易察觉 7 煮熟牡蛎特征香气一般，可察觉 5~6 煮熟牡蛎特征香气较淡，不易察觉 3~4 无煮熟牡蛎肉特征香气 1~2 焦香味
（8分）焦糖香气浓郁 8 焦糖香气较明显，易察觉 7 焦糖香气一般，可察觉 5~6 焦糖香气较淡，不易察觉 3~4 无焦糖香气 1~2 糊味
（8分）无糊味 8 糊味较淡，不易察觉 7 糊味一般，可接受 5~6 糊味较重，难以忍受 3~4 糊味严重，令人恶心 1~2 腥味
（8分）无腥味 7~8 腥味较淡 5~6 腥味较重，难以忍受 3~4 腥味刺激，难以忍受 1~2 滋味
（30分）生牡蛎肉特征鲜味
（15分）生牡蛎肉特征鲜味浓郁 12~15 生牡蛎肉特征鲜味较明显，易察觉 9~11 生牡蛎肉特征鲜味一般，可察觉 6~8 生牡蛎肉特征鲜味较淡，不易察觉 3~5 无生牡蛎肉特征鲜味 1~2 苦味
（15分）无苦涩味 10~15 苦涩味一般，可忍受 7~9 苦涩味较重，难以忍受 4~6 苦涩味严重，无法接受 1~3 色泽
（15分）棕褐色，色泽均匀，深浅适中，美观 10~15 深棕色或浅棕色，色泽均匀，比较美观 7~9 灰白色，色泽均匀，可接受 4~6 其他颜色/黄绿色，难以接受 1~3 形态
（15分）微稠/粘稠，均匀无分层，无异物， 10~15 略稀/易流动，均匀无分层，少量异物 7~9 稀液体，轻微分层，少量杂质 4~6 稀液体，分层严重，杂质多 1~3 1.2.8 AAN含量的测定
AAN的测定参考国标GB 5009.235-2016中甲醛滴定法[17]。
1.2.9 GC-IMS测定
量取2 mL样品置于20 mL顶空进样瓶中，进样体积200 μL，进样针温度60 ℃。采用极性柱（MXT-WAX 15 m×0.53 mm×1μm），柱温50 ℃，IMS温度45 ℃，EI流速设置为150 mL/min，载气为氮气。
1.2.10 游离氨基酸测定
参考宋仪等[18]的方法略作修改，分别准确称量2 g未发酵牡蛎酶解液、发酵牡蛎酶解液、和调味发酵牡蛎酶解液，加入10 mL 0.02 mol/L稀盐酸，充分振摇30 min，离心（8000 r/min，4 ℃）10 min，吸取上清液。将剩余残渣加入10 mL 0.02 mol/L稀盐酸后搅拌，再次离心（8000 r/min，4 ℃）10 min，合并上清液，定容至25 mL。移取定容后的液体2 mL，加入10 mL质量分数10%的三氯乙酸溶液，静置2 h后再次离心（8000 r/min，4 ℃）10 min，经0.22μm水相滤膜过滤后，进入全自动氨基酸分析仪测定。得到结果进行滋味活性值（Taste Active Value，TAV）计算。TAV表示每种滋味物质含量（mg/100 g）与滋味阈值（mg/100 g）的比值。
1.2.11 感官描述风味剖面分析
为详细描述未发酵牡蛎酶解液、发酵牡蛎酶解液、调味发酵牡蛎酶解液的风味差异，根据GB/T 12313-1990《感官分析方法 风味剖面检验》的要求，进行感官描述风味剖面分析。感官所使用的样品处理同1.2.2。使用蚝汁专属感官描述词库中选择频率较高的七个感官属性作为评估蚝汁特征风味的代表性描述词，分别为“鲜蚝香”“熟蚝香”“焦香”“糊味”“鲜味”“苦味”和“腥味”。采用10分制对每种感官属性的总体喜好（10分最高）进行评估打分。每组样品评估三次，最终结果取所有感官评价成员打分结果的平均值。
1.3 数据处理
实验数据均进行了三次平行测定，由Excel 2010和SPSS 22.0对数据进行统计分析，P<0.05表示具有显著性差异，分析结果表示为平均值±标准差，利用Origin 2022对分析结果进行绘图。使用Library Search（Version 1.0.8）工作站，比较RI和GC-IMS库分析定性化合物，利用LAV（Version 2.21版本，G.A.S公司出品）工作站完成实验数据识别、整理及绘图工作。
2. 结果与分析
2.1 乳山牡蛎、漳州牡蛎基本营养成分分析
AAN指的是以氨基酸形式存在的氮元素的含量，是蚝汁中的重要组成成分，也是蚝汁在调味时鲜味的主要来源，常用于评价调味品产品品质。蚝汁中的AAN由制造蚝汁的原料（牡蛎）中的蛋白质水解产生的。因此，选择蛋白质含量高的牡蛎品种来生产蚝汁，是提高AAN含量的关键。国内牡蛎品种众多，而地域差异对水产品生长有较大影响，因此分别选取了南北方牡蛎的优质品种，乳山牡蛎为北方地区代表性的牡蛎品种之一，漳州牡蛎为南方代表的牡蛎品种之一，乳山牡蛎、漳州牡蛎基本营养成分对比如表2所示。结果表明，乳山牡蛎总蛋白含量为13.52%±0.09%，高于漳州牡蛎，因此本研究选取乳山牡蛎作为蚝汁的加工的原料。
表 2 乳山牡蛎、漳州牡蛎基本营养成分对比Table 2. Comparison of basic nutritional composition of Rushan oysters and Zhangzhou oysters样品 蛋白质（%） 水分（%） 脂肪（%） 灰分（%） 糖原（%） 漳州牡蛎 12.74±0.04 80.48±0.01 0.72±0.05 1.42±0.01 1.23±0.04 乳山牡蛎 13.52±0.09 81.53±0.03 0.50±0.01 1.44±0.02 0.81±0.06 2.2 蚝汁专用感官描述词库建立
在实验室专业的感官评价小组中，通过CATA和FCP方法对市售蚝汁进行评估，形成了许多感官描述词。根据描述词出现频率和评价小组成员的讨论、参比分析后，产生了29个蚝汁专属感官描述词。用这些感官描述词整理形成了一个蚝汁专属风味轮盘（图1），轮盘外圈是29个对蚝汁特征气味的精确描述，内圈是对外圈精确描述的具体属性进行的分类，共分为7类，分别是熟蚝香、清香、油脂香、腥味、鲜蚝香、异味和烘焙香。其中，外圈涉及到的烟熏味、焦糖香、烤坚果味在蚝油中被鉴定出，常被用于描述发酵调味料的感官特征[19−20]。经过讨论，感官小组成员均同意使用强度较高的五个感官属性作为后续评估蚝汁整体特征风味的代表性描述词，分别为鲜蚝香、熟蚝香、焦香、糊味、鲜味、苦味、鲜味和腥味。
2.3 发酵提质增鲜工艺单因素实验结果
2.3.1 发酵菌种的筛选
不同品种乳酸菌常被用于发酵各种食品，其中具有蛋白水解能力的乳酸菌发酵水产品可以产生良好的风味并且提高产品的营养品质[21]。酵母发酵作为一种重要的生物脱腥法已经得到广泛的应用[22]。本研究应用了从牡蛎中分离纯化出的两种乳酸菌和两种酵母菌对牡蛎酶解液进行发酵，对感官评分和AAN含量的影响见图2。戊糖乳杆菌发酵后酶解液AAN含量最高，为0.46±0.08 g/100 g，比未发酵酶解液显著提高（P<0.05），其次为植物乳杆菌和酿酒酵母，赤霞酵母发酵酶解液AAN含量最低，乳杆菌发酵提高酶解液AAN含量可能与牡蛎内源性组织蛋白和微生物蛋白酶在发酵过程中的作用有关，使得酶解液中的大分子蛋白质在发酵过程中不断被水解成游离的蛋白[23−24]。乳酸发酵通常产生酸味，过度发酵可能降低感官品质，戊糖乳杆菌和植物乳杆菌发酵的牡蛎酶解液感官风味劣于酿酒酵母和赤霞酵母发酵效果，但是综合提升AAN含量的效果，最终选用戊糖乳杆菌作为发酵牡蛎酶解液的最优菌种，后续进行探索适度发酵条件以提升感官品质。
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2.3.2 发酵条件单因素实验结果
发酵的效率受到诸多因素的影响，例如发酵温度、发酵时间、菌液接种量等[25]。本研究将感官评分和AAN含量作为评价指标，用于评价以上因素对戊糖乳杆菌发酵牡蛎酶解液提质增鲜的效果。
乳酸菌在30~35 ℃生命活动旺盛，具有较好的发酵效果。发酵温度对戊糖乳杆菌发酵牡蛎酶解液AAN含量和感官评分的影响如图3所示。随着温度的上升，AAN含量出现先上升后降低的趋势，发酵温度在37 ℃时，AAN含量最高，说明该温度是戊糖乳杆菌在牡蛎酶解液中生长的适宜温度，且活菌数较多[26]，牡蛎酶解液中的蛋白被戊糖乳杆菌充分利用，水解生成了小分子的游离态AAN。温度在33~39 ℃范围内对感官品质没有显著影响（P>0.05），呈现出一定的乳酸菌特有的发酵酸味，比未发酵酶解液的感官评分高。综合考虑AAN含量和感官评分的变化，选择发酵温度37 ℃作为戊糖乳杆菌发酵牡蛎酶解液的最佳温度。
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图 3 发酵温度对牡蛎酶解液感官评分和AAN含量的影响Figure 3. Effects of sensory score and AAN content of oyster enzymatic hydrolysates fermented at different temperatures适宜的发酵时间能够让乳酸菌充分而又不过度降解并利用蛋白质等大分子营养物质，产生丰富的风味化合物[27]。发酵时间对AAN含量和感官评分的影响如图4所示。随着发酵时间的延长，AAN含量出现缓慢升高趋势，在发酵3 h时AAN含量达到了0.5±0.009 g/100 g，随后AAN含量略有增加但无显著差异（P<0.05），直至24 h时，AAN含量降低，可能是过度发酵使酶生长导致氨基酸被分解[22]，造成了AAN含量的降低；但感官评分出现先升高后降低的趋势，发酵3 h时酶解液腥味减弱，乳酸发酵的特征酸味对异味起到了一定的掩蔽作用，随着发酵时间延长，乳酸菌发酵酸味越明显，到24 h时产生刺激性气味。因此综合感官评分和AAN含量，选择时间较短的3 h轻度发酵作为戊糖乳杆菌发酵牡蛎酶解液的最佳时间。
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图 4 发酵时间对牡蛎酶解液感官评分和AAN含量的影响Figure 4. Effects of sensory score and AAN content of oyster enzymatic hydrolysates fermented for different durations戊糖乳杆菌接种量对发酵牡蛎酶解液AAN含量和感官评分的影响如图5所示。随着接种量的增加，AAN含量呈现逐渐增多的趋势，接种量为10%时，AAN含量最高，但是感官评分不佳，接种量为6%时感官评分最佳，但AAN含量不是最高，接种量为7%时AAN含量为0.5±0.007 g/100 g，感官评分为5.3±0.556，仅次于6%的接种量。因此，综合考虑AAN含量和感官评分的因素，选择7%作为戊糖乳杆菌发酵牡蛎酶解液的最佳接种量。
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图 5 戊糖乳杆菌接种量对牡蛎酶解液感官评分和AAN含量的影响Figure 5. Effects of sensory score and AAN content of oyster enzymatic hydrolysates fermented at different inoculation levels综上，戊糖乳杆菌发酵牡蛎酶解液最优条件为：发酵温度37 ℃、发酵时间3 h、接种量为7%，此条件下发酵牡蛎酶解液的感官品质最好，发酵牡蛎酶解液的AAN含量为0.5±0.007 g/100 g，感官评分为5.3±0.556，优于未发酵牡蛎酶解液。
2.3.3 发酵牡蛎酶解液调味工艺单因素实验结果
发酵牡蛎酶解液与成品蚝汁相比，甜味不足，而甜味是促进鲜味释放的影响因素之一[28]，因此选择外源加入无水葡萄糖以促进风味的释放；通常在蚝汁中添加食盐以提高渗透压，从而实现防腐的目的，并且食盐的存在也会影响风味化合物的释放[10]；调味发酵牡蛎酶解液中存在丰富的游离氨基酸，葡萄糖的加入满足了美拉德反应发生的底物条件，通过短时高温高压（100 kPa、121 ℃、20 min），使发酵酶解液发生美拉德反应，可产生蚝汁所需要的棕褐色泽和焙烤香气，更接近蚝汁的感官品质和营养品质，并且短时高温高压还可替代灭酶和灭菌过程，使产品达到无菌状态。
添加不同含量葡萄糖和食盐后对发酵酶解液进行短时间高温高压处理，其AAN含量和感官评分如图6a、图6b所示。葡萄糖和食盐的添加对短时高温高压处理后的发酵酶解液AAN含量没有显著影响（P<0.05），但感官评分出现较大差异。当葡萄糖添加量为8%时，感官评分最高，葡萄糖与氨基酸发生美拉德反应速率较快[29]，产生较好的焙烤和焦糖风味掩蔽了发酵酶解液的腥味和酸味，并且葡萄糖的价格比其他还原性糖低廉易得[11]；当食盐添加量为2%时，发酵牡蛎酶解液的感官评分最高，口感微咸，酱香味浓重，但当食盐添加量逐渐增加时样品苦味加重，咸度逐渐不可接受。因此确定葡糖添加量最优为8%，食盐添加量最优为2%。如图6c所示，随着浓缩倍数的增加，AAN含量和感官评分呈现出递增的趋势，当浓缩为原来体积的50%时，AAN含量最高，达到1.06±0.03 g/100 g，在感官和品质上最接近消费者对蚝汁的需求。
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图 6 不同调味方式对短时高温高压处理发酵牡蛎酶解液感官评分和AAN含量的影响注：a、b、c分别为葡萄糖添加量、食盐添加量和浓缩倍数对短时高温高压处理发酵牡蛎酶解液感官评分和AAN含量的影响。Figure 6. Effects of different seasoning methods on sensory score and AAN content of fermented oyster enzymatic hydrolysate treated with short-time high-temperature and high-pressure treatment2.4 游离氨基酸组成及TAV分析
发酵食品中的风味发展取决于发酵微生物的代谢，尤其是氨基酸的代谢[30]，例如游离氨基酸等，游离氨基酸是包括牡蛎在内的海洋无脊椎动物中主要的非挥发性滋味活性化合物[31]。未发酵牡蛎酶解液、发酵牡蛎酶解液、调味发酵牡蛎酶解液的游离氨基酸组成和含量变化如图7所示。与未发酵牡蛎酶解液相比，发酵酶解液与调味发酵牡蛎酶解液的呈甜味和鲜味的氨基酸含量增加，推测戊糖乳杆菌发酵与美拉德反应是鲜甜味氨基酸含量增加的原因；经过戊糖乳杆菌发酵后，牡蛎酶解液的苦味氨基酸含量增加，但经过调味和短时高温高压反应后，苦味氨基酸含量下降。综上所述，牡蛎酶解液经过发酵或调味处理后游离氨基酸组成发生变化，与未发酵酶解液相比滋味更加鲜甜，且调味处理有利于改善和掩盖酶解液本身的苦味，对牡蛎酶解液的滋味具有积极影响。
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图 7 三种样品不同呈味特点的游离氨基酸含量的变化注：色块中的数字代表游离氨基酸含量（mg/100 g）。Figure 7. Changes in the different taste presentation characteristic free amino acid content in three samples with滋味化合物对味觉的相对重要性可以通过TAV来度量[32]。未发酵牡蛎酶解液、发酵牡蛎酶解液、调味发酵牡蛎酶解液的游离氨基酸含量和TAV如表3所示，TAV用于确定游离AAN对滋味的贡献[33]。多项研究表明，在水产品中呈鲜味的游离氨基酸主要是天冬氨酸（Asp）和谷氨酸（Glu）[34]。在发酵牡蛎酶解液中Asp含量为82.46±4.95 mg/100 g、Glu为256.61±15.12 mg/100 g，显著高于其他未发酵牡蛎酶解液和调味发酵牡蛎酶解液（P<0.05）。根据TAV值判断，Glu是使三种样品呈现鲜味的主要氨基酸；Ala是使三种样品呈现甜味的主要氨基酸，且含量均大于100 mg/100 g。有研究证明Ala是影响风味特征的关键前体[6]。因此，Asp含量的增加，是发酵或调味处理后滋味更为鲜甜的原因，说明戊糖乳杆菌发酵和调味处理可促进牡蛎酶解液良好滋味物质的生成，有利于增强牡蛎酶解液的鲜味和甜味。
表 3 未发酵牡蛎酶解液、发酵牡蛎酶解液、调味发酵牡蛎酶解液的游离氨基酸和TAV含量Table 3. Free amino acid and TAV content in unfermented oyster hydrolysate, fermented oyster hydrolysate and seasoning fermented oyster hydrolysate游离氨基酸 呈味特性 滋味阈值
（mg/100 g）未发酵牡蛎酶解液 发酵牡蛎酶解液 调味发酵牡蛎酶解液 含量（mg/100 g） TAV 含量（mg/100 g） TAV 含量（mg/100 g） TAV Asp 鲜（+） 100.00 54.79±1.01c 0.55 82.46±4.95a 0.82 79.59±3.4b 0.80 Thr 甜（+） 260.00 135.85±2.25b 0.52 207.87±12.35a 0.80 81.67±3.31c 0.31 Ser 甜（+） 150.00 67.45±1.1c 0.45 95.04±5.56a 0.63 79.07±3.4b 0.53 Glu 鲜（+） 30.00 174.89±2.95b 5.83 256.61±15.12a 8.55 171.15±2.4c 5.71 Gly 甜（+） 130.00 69.14±1.13c 0.53 83.05±4.38b 0.64 110.46±3.81a 0.85 Ala 甜（+） 60.00 114.58±1.79c 1.91 154.55±8.57a 2.58 152.41±3.61b 2.54 Val 甜/苦（+） 40.00 82.28±1.23c 2.06 114.51±6.43a 2.86 83.33±3.18b 2.08 Met 苦/甜（−） 300.00 46.9±0.63b 1.56 66.28±4.06a 0.22 41.63±1.66c 0.14 Ile 苦（−） 90.00 74.72±1.16b 1.87 110.02±6.2a 1.22 72.33±4.08c 0.80 Leu 苦（−） 190.00 139.68±2.34c 0.37 200.16±11.04a 1.05 156.57±6.03b 0.82 Tyr 苦（−） 90.00 95.56±1.64c 1.06 129.7±8.44a 1.44 119.14±5.12b 1.32 Phe 苦（−） 90.00 91.1±1.41c 1.01 119.83±7.03a 1.33 108.84 4.73b 1.21 Lys 苦/甜（−） 50.00 133.64±2.09b 2.67 181.11±10.32a 3.62 87.47 3.6c 1.75 His 苦（−） 20.00 30.02±0.51b 1.50 48.85±2.9a 2.44 9.39±0.38c 0.47 Arg 甜/苦（+） 50.00 156.61±2.22b 3.13 218.65±13.45a 4.37 43.34±8.53c 0.87 Cys − − 94.9±1.16a − 16.81±0.81b - 1.51±1.55c - 注：不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。 2.5 挥发性化合物对比分析
GC-IMS因其快速定性和准确定量的特点而成为受欢迎的食品风味分析技术[35]。GC-IMS技术具有灵敏度高、操作简便、可视化性强、无环境污染等优点，在挥发性组分的快速检测方面显示出巨大的潜力[32]。通过GC-IMS对未发酵牡蛎酶解液、发酵牡蛎酶解液、调味发酵牡蛎酶解液的气味进行鉴定，发现三者的风味轮廓具有较大的差异，图8a的主成分分析的结果表明三者的气味具有较好的分离性（PC1：68.4% PC2：29.87%），样品的气味组成在组间差异较大，组内差异较小。在未发酵牡蛎酶解液、发酵牡蛎酶解液、调味发酵牡蛎酶解液中共鉴定出24种醇、17种醛、11种酯、8种酮、7种酸、7种烯烃、6种吡嗪、6种酚、1种硫醚和1种呋喃和1种烷烃类化合物（图8b）。
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图 8 基于GC-IMS鉴定不同处理牡蛎酶解液中挥发性化合物情况注：a、b分别为主成分分析图和挥发性化合物种类。Figure 8. Volatile compounds in oyster hydrolysate of different treated oysters were identified by GC-IMS同时，GC-IMS可形成样品风味专属的指纹图谱，从而可以直观准确地区分样品之间的差异[36]。未发酵牡蛎酶解液、发酵牡蛎酶解液、调味发酵牡蛎酶解液的指纹图谱如图9所示，图9中列代表不同样品间挥发性化合物含量变化，行代表同一样品中不同挥发性化合物的含量，方格的颜色表示挥发性成分的浓度，颜色越亮，含量越高。研究表明，牡蛎水解物中的异味主要为3-甲基丁醛、己醛、1-戊烯-3-醇、2-戊基呋喃、（Z）-4-庚烯醛、（E,E）-2,4-庚二烯醛[6,35−37]。如图9所示，其中具有强烈腥味、脂肪味、草味和金属味的己醛、1-戊烯-3-醇、3-甲基丁醛和（E,E）-2,4-庚二烯醛经戊糖乳杆菌发酵后响应度显著降低（P<0.05），且经调味后短时高温高压处理，上述四种挥发性化合物的浓度进一步降低，腥味等异味的减弱与后续感官评价结果一致。己醛和1-戊烯-3-醇会产生脂肪酸败气味，所以二者常被用于判断水产品和加工水产品是否新鲜[38]。己醛、3-甲基丁醛和（E,E）-2,4-庚二烯醛的减少可能是由于加入的戊糖乳杆菌通过消耗水解物中的溶解氧抑制了脂肪的氧化作用，并且接种的微生物会将醛转化为相应的醇或酸[7]。此外，乳杆菌在生长和代谢过程中可以通过自身的酸脱氢酶将己醛转化为己酸，然后酸性物质可以进一步转化为具有良好气味的酯[39−40]，从而改善牡蛎酶解液的风味；调味后短时高温高压反应生成了2-甲基吡嗪等吡嗪类化合物，赋予了牡蛎酶解液焙烤香气和焦糖香气，使之具有蚝油的特征香气[14]。
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图 9 未发酵牡蛎酶解液、发酵牡蛎酶解液、调味发酵牡蛎酶解液指纹图图谱Figure 9. Fingerprint of unfermented oyster hydrolysate, fermented oyster hydrolysate and seasoning fermented oyster hydrolysate综上，戊糖乳杆菌的生长代谢可以实现对牡蛎酶解液中引腥味、脂肪味、草味和金属味等异味物质的生物转化[7]，产生令人愉快的酯类等香气物质，达到消除或掩蔽腥味的效果；调味后高温高压处理所产生的美拉德反应产生了具有焙烤香气的吡嗪类化合物，丰富了牡蛎酶解液的感官品质。这说明发酵和调味后高温高压处理能明显改善酶解液的感官风味特征，迎合广大消费者对蚝汁调味品的需求。
2.6 感官描述风味剖面分析
使用选择频率较高的七个感官属性作为评估蚝汁特征风味的代表性描述词，分别为鲜蚝香、熟蚝香、焦香、糊味、鲜味、苦味和腥味，未发酵牡蛎酶解液、发酵牡蛎酶解液、调味发酵牡蛎酶解液三组样品的风味特征进行评估。根据图10可知，三组样品风味剖面具有较大差异。发酵牡蛎酶解液的鲜蚝香减弱，熟蚝香增强，且蚝汁特征焦香味、糊味比未发酵牡蛎酶解液与调味发酵牡蛎酶解液强烈；经过戊糖乳杆菌发酵和调味短时高温高压处理后，牡蛎酶解液的腥味减弱，但苦味、和鲜味与未发酵牡蛎酶解液相比较重，与游离氨基酸分析中鲜味和苦味氨基酸含量变化一致。但总体来说，与未发酵牡蛎酶解液相比，调味发酵牡蛎酶解液的整体风味得到改善，易被消费者接受。
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图 10 未发酵牡蛎酶解液、发酵牡蛎酶解液、调味发酵牡蛎酶解液风味雷达图Figure 10. Flavor radar chart of unfermented oyster hydrolysate, fermented oyster hydrolysate, and seasoning fermented oyster hydrolysate3. 结论
乳山牡蛎因其高蛋白含量被确定为蚝汁加工适用原料，感官描述词库被初步确立专适用于蚝汁；经单因素筛选确定出发酵牡蛎酶解液的最优工艺为戊糖乳杆菌发酵，发酵温度37 ℃，发酵时间3 h，接种量7%，此时AAN含量为0.5±0.009 g/100 g；调味最佳工艺为添加8%葡萄糖和2%食盐，经短时间高温高压处理后浓缩为60%，此时AAN含量为1.06±0.03 g/100 g，牡蛎酶解液的品质得到提升。经戊糖乳杆菌发酵和调味后的牡蛎酶解液鲜甜味氨基酸含量增加，说明处理对牡蛎酶解液的滋味有改善作用；经戊糖乳杆菌发酵后，牡蛎酶解液中特有的异味物质3-甲基丁醛、己醛、1-戊烯-3-醇和（E,E）-2,4-庚二烯醛含量降低，经调味后短时高温高压处理后，其含量进一步降低，说明处理对牡蛎酶解液的气味有改善作用；综合戊糖乳杆菌发酵和调味处理后对牡蛎酶解液的品质、气味和滋味的改善作用，证明发酵酶解工艺对蚝汁的工艺改进具有一定的可行性和指导意义。
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图 3 发酵温度对牡蛎酶解液感官评分和AAN含量的影响
Figure 3. Effects of sensory score and AAN content of oyster enzymatic hydrolysates fermented at different temperatures
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图 4 发酵时间对牡蛎酶解液感官评分和AAN含量的影响
Figure 4. Effects of sensory score and AAN content of oyster enzymatic hydrolysates fermented for different durations
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图 5 戊糖乳杆菌接种量对牡蛎酶解液感官评分和AAN含量的影响
Figure 5. Effects of sensory score and AAN content of oyster enzymatic hydrolysates fermented at different inoculation levels
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图 6 不同调味方式对短时高温高压处理发酵牡蛎酶解液感官评分和AAN含量的影响
注：a、b、c分别为葡萄糖添加量、食盐添加量和浓缩倍数对短时高温高压处理发酵牡蛎酶解液感官评分和AAN含量的影响。
Figure 6. Effects of different seasoning methods on sensory score and AAN content of fermented oyster enzymatic hydrolysate treated with short-time high-temperature and high-pressure treatment
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图 7 三种样品不同呈味特点的游离氨基酸含量的变化
注：色块中的数字代表游离氨基酸含量（mg/100 g）。
Figure 7. Changes in the different taste presentation characteristic free amino acid content in three samples with
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图 8 基于GC-IMS鉴定不同处理牡蛎酶解液中挥发性化合物情况
注：a、b分别为主成分分析图和挥发性化合物种类。
Figure 8. Volatile compounds in oyster hydrolysate of different treated oysters were identified by GC-IMS
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图 9 未发酵牡蛎酶解液、发酵牡蛎酶解液、调味发酵牡蛎酶解液指纹图图谱
Figure 9. Fingerprint of unfermented oyster hydrolysate, fermented oyster hydrolysate and seasoning fermented oyster hydrolysate
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图 10 未发酵牡蛎酶解液、发酵牡蛎酶解液、调味发酵牡蛎酶解液风味雷达图
Figure 10. Flavor radar chart of unfermented oyster hydrolysate, fermented oyster hydrolysate, and seasoning fermented oyster hydrolysate
表 1 蚝汁感官评价标准
Table 1 Sensory evaluation standards for oyster juice
项目 风味名称 风味描述 感官评分
（分）气味
（40分）鲜牡蛎肉特征香气
（8分）牡蛎肉特征香气浓郁，怡人 8 牡蛎肉特征香气较明显，易察觉 7 牡蛎肉特征香气一般，可察觉 5~6 牡蛎肉特征香气较淡，不易察觉 3~4 无牡蛎肉特征香气 1~2 熟蚝香气
（8分）煮熟牡蛎特征香气浓郁，怡人 8 煮熟牡蛎特征香气较明显，易察觉 7 煮熟牡蛎特征香气一般，可察觉 5~6 煮熟牡蛎特征香气较淡，不易察觉 3~4 无煮熟牡蛎肉特征香气 1~2 焦香味
（8分）焦糖香气浓郁 8 焦糖香气较明显，易察觉 7 焦糖香气一般，可察觉 5~6 焦糖香气较淡，不易察觉 3~4 无焦糖香气 1~2 糊味
（8分）无糊味 8 糊味较淡，不易察觉 7 糊味一般，可接受 5~6 糊味较重，难以忍受 3~4 糊味严重，令人恶心 1~2 腥味
（8分）无腥味 7~8 腥味较淡 5~6 腥味较重，难以忍受 3~4 腥味刺激，难以忍受 1~2 滋味
（30分）生牡蛎肉特征鲜味
（15分）生牡蛎肉特征鲜味浓郁 12~15 生牡蛎肉特征鲜味较明显，易察觉 9~11 生牡蛎肉特征鲜味一般，可察觉 6~8 生牡蛎肉特征鲜味较淡，不易察觉 3~5 无生牡蛎肉特征鲜味 1~2 苦味
（15分）无苦涩味 10~15 苦涩味一般，可忍受 7~9 苦涩味较重，难以忍受 4~6 苦涩味严重，无法接受 1~3 色泽
（15分）棕褐色，色泽均匀，深浅适中，美观 10~15 深棕色或浅棕色，色泽均匀，比较美观 7~9 灰白色，色泽均匀，可接受 4~6 其他颜色/黄绿色，难以接受 1~3 形态
（15分）微稠/粘稠，均匀无分层，无异物， 10~15 略稀/易流动，均匀无分层，少量异物 7~9 稀液体，轻微分层，少量杂质 4~6 稀液体，分层严重，杂质多 1~3 
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表 2 乳山牡蛎、漳州牡蛎基本营养成分对比
Table 2 Comparison of basic nutritional composition of Rushan oysters and Zhangzhou oysters
样品 蛋白质（%） 水分（%） 脂肪（%） 灰分（%） 糖原（%） 漳州牡蛎 12.74±0.04 80.48±0.01 0.72±0.05 1.42±0.01 1.23±0.04 乳山牡蛎 13.52±0.09 81.53±0.03 0.50±0.01 1.44±0.02 0.81±0.06
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表 3 未发酵牡蛎酶解液、发酵牡蛎酶解液、调味发酵牡蛎酶解液的游离氨基酸和TAV含量
Table 3 Free amino acid and TAV content in unfermented oyster hydrolysate, fermented oyster hydrolysate and seasoning fermented oyster hydrolysate
游离氨基酸 呈味特性 滋味阈值
（mg/100 g）未发酵牡蛎酶解液 发酵牡蛎酶解液 调味发酵牡蛎酶解液 含量（mg/100 g） TAV 含量（mg/100 g） TAV 含量（mg/100 g） TAV Asp 鲜（+） 100.00 54.79±1.01c 0.55 82.46±4.95a 0.82 79.59±3.4b 0.80 Thr 甜（+） 260.00 135.85±2.25b 0.52 207.87±12.35a 0.80 81.67±3.31c 0.31 Ser 甜（+） 150.00 67.45±1.1c 0.45 95.04±5.56a 0.63 79.07±3.4b 0.53 Glu 鲜（+） 30.00 174.89±2.95b 5.83 256.61±15.12a 8.55 171.15±2.4c 5.71 Gly 甜（+） 130.00 69.14±1.13c 0.53 83.05±4.38b 0.64 110.46±3.81a 0.85 Ala 甜（+） 60.00 114.58±1.79c 1.91 154.55±8.57a 2.58 152.41±3.61b 2.54 Val 甜/苦（+） 40.00 82.28±1.23c 2.06 114.51±6.43a 2.86 83.33±3.18b 2.08 Met 苦/甜（−） 300.00 46.9±0.63b 1.56 66.28±4.06a 0.22 41.63±1.66c 0.14 Ile 苦（−） 90.00 74.72±1.16b 1.87 110.02±6.2a 1.22 72.33±4.08c 0.80 Leu 苦（−） 190.00 139.68±2.34c 0.37 200.16±11.04a 1.05 156.57±6.03b 0.82 Tyr 苦（−） 90.00 95.56±1.64c 1.06 129.7±8.44a 1.44 119.14±5.12b 1.32 Phe 苦（−） 90.00 91.1±1.41c 1.01 119.83±7.03a 1.33 108.84 4.73b 1.21 Lys 苦/甜（−） 50.00 133.64±2.09b 2.67 181.11±10.32a 3.62 87.47 3.6c 1.75 His 苦（−） 20.00 30.02±0.51b 1.50 48.85±2.9a 2.44 9.39±0.38c 0.47 Arg 甜/苦（+） 50.00 156.61±2.22b 3.13 218.65±13.45a 4.37 43.34±8.53c 0.87 Cys − − 94.9±1.16a − 16.81±0.81b - 1.51±1.55c - 注：不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。
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